202278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott stabilitású, rekombináns gamma-interferonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
13 HU 202278 B 14 malombant például Gaulin-malomban homogenizáljuk. Az oldathoz annyi polietilénimint adunk, hogy a koncentrációja 0,1-1 vegyes* legyen. A felülúszó folyadék tartalmazza a gamma-interferont. b. A vekombináns gamma-interferon részleges tisztítása szilicium-dioxid-alapú adszorbensen A fenti a) pont szerint kapott felülúszó folyadékot szilícium-dioxid-alapú adszorbensen adszorbeáljuk, az adszorbenst a szenynyező anyagok eltávolítására 6-9 közötti pH-értékű megfelelő sóoldatokkal mossuk. A rekombináns gamma-interferont 0,5-1,0 M tetrametil-ammónium-kloridot tartalmazó oldattal eluáljuk. A részleges tisztítás valamennyi lépését 7-9 közötti pH-tartomány ban hajtjuk végre. c. A rekombinéns gamma-interferon részleges tisztítása anioncserélö kroma togréfié val A fenti b) pont szerint kapott eluátumot dializáljuk és anioncserélö kromatografáló oszlopon adszorbeáljuk, amelyről mosással távolítjuk el a szennyező anyagokat. A rekombináns gamma-interferont növekvő sókoncentrációjú oldattal eluáljuk. Erre a célra alkalmazható jellemző anioncserélö gyanta például a karboxi-metil-cellulóz és a szulfo-etil-cellulóz. Valamennyi műveletet 7-9 közötti pH-tartományban vitelezzük ki. d. A rekombinéns gamma-interferon részleges tisztítása kalcium-foszfát gélen végzett kromatográfiával A fenti c) pont szerint kapott eluátumot kalcium-foszfáton adszorbeáljuk, majd ez utóbbiról mosással eltávolítjuk a szennyező anyagokat. A rekombináns gamma-interferont növekvő sókoncentrációjú és növekvő foszfátkoncentrációjü oldatokkal eluáljuk. Az összes műveletet ennél a lépésnél 7-9 közötti pH-tartományban vitelezzük ki. e. A rekombinéns gamma-interferon részleges tisztítása anioncserélö kroma tog rá fiá val A fenti d) pont szerint kapott eluátumot dializáljuk és anioncserélő kromatografáló oszlopon adszorbeáljuk, amelyről mosással távolitjuk el a szennyező anyagokat. A rekombináns gamma-interferont növekvő sókoncentrációjú oldattal eluáljuk. Erre a célra alkalmazható jellegzetes anioncserélö kromatografáló gyanta például a karboxi-metil-cellulóz és a szulfo-etil-cellulóz. Az összes műveletet ennél a lépésnél 7-9 közötti pH-tartományban vitelezzük ki. f. A rekombináns gamma-interferon részleges tisztítása gélpermeációs kroma togréfié val A fenti e) pont szerint kapott eluátumot visszük fel a gélpermeációs oszlopra, amelyet sóoldattal eluálunk. A rekombináns gamma-interferont tartalmazó frakciókat egyesítjük a hatóanyag elkülönítése céljából. Az összes műveletet ennél a lépésnél 7-9 közötti pH-tartományban vitelezzük ki. g. A C-terminélis aminosav-szekvencia A C-terminális szekvencia meghatározásához a mintákat 70%-os hangyasav alkalmazásával dializáltuk, a polipeptid láncot cianogénbromiddal elhasítottuk, majd a kapott peptideket Altex Ultrasphere C8 fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon választottuk szét. A maximumoknak megfelelő frakciókat összegyűjtöttük, majd aminosav- és szekvencia-analízisnek vetettük aló. Az egyik C-terminális peptid -leu-phe-arg-gly-arg volt (az 1. ábrán látható 135- -139 számú rész). Némelyik esetben egy további peptidet is kimutattunk: -leu-phe-arg-gly-arg-arg-ala-ser-gln (az 1. ábrán látható 135-143 számú rész). E két peptid egymáshoz viszonyított arányát úgy határoztuk meg, hogy az aminosav-analizis alapján ismert mennyiségeket vittünk a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatografáló oszlopra, és meghatároztuk a peptidekhez tartozó maximumok magasságát. Három sarzsnál végeztük el ezeket a vizsgálatokat, és mindegyik esetben azt tapasztaltuk, hogy kevesebb mint 2% mennyiségben van jelen a hosszabb peptid, míg a rövidebb peptid mennyisége több mint 98*. Ezek az adatok összhangban vannak azzal, hogy az Escherichia coli 139 aminosavból és 143 aminosavból álló interferonok elegyét termeli - nem számítva az N-terminális metionint, amely mindegyik esetben szintén jelen van -, s a mennyiségük körülbelül 98* illetve mintegy 2X. 5. Gyógyászati készítmény előállítása A fentiek szerint előállított rekombináns gamma-interferont célszerűen parenterálisan beadható gyógyászati készítménnyé alakítjuk. Ennek összetétele az alábbi. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
