202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
9 HU 202277 B 10 vagy 6%-os poliakrilatnid gélben végezzük. A restrikciós fragmentumok preparálása úgy történik, hogy a kívánt fragmentumot tartalmazó géldarabkát kivágjuk és a gélből a DNS-t dializáló hüvelyben elektroforézissel eluáljuk. 3) Kinéz-, foszfatáz- és ligéz reakciók Az ö'-foszforilálást (végek jelzése) 5 mM DTT-t és 0,2-0,5 mM ATP-t (10-20 yCií32P-ATP) tartalmazó TM pufferben [70 mM trisz-sÓ6av (pH=7,5), 7 mM magnézium-klorid] végezzük 5 egység T4 polinukleotid kinázzal (Bethesda Research Laboratories cég gyártmánya) 60 percig, 37 °C-on. A reakcióelegyet ezután 70 °C-on 10 percig inkubáljuk, hogy az enzim inaktiválódjék. A ligáz reakciókat 5 mM DTT-t és 0,25 mM ATP-t tartalmazó TM pufferben folytatjuk le a .blunt-end* összekapcsolásoknál 0,1 egység T4 DNS ligázzal (Bethesda Research Laboratories), a kohéziós végek öszszekapcsolásánál 0,005 egység ligázzal, egy éjszakán át 14 °C-on. Ezután az enzimet 70 °C-on 10 percig denaturáljuk. Az egymásután kővetkező kinéz és ligáz reakciókat ugyanabban a reakciókeverékben folytatjuk le. Az első enzim hódenaturálása után a keverékhez újból hozzáadunk 5 mM DTT-t és 0,25-0,5 mM ATP-t és ezután indítjuk a második reakciót. A foszfatáz reakciókat a restrikciós emésztésekhez alkalmas pufferben (szokásosan TA pufferben) végezzük úgy, hogy 1 egység alkalikus foszfatázt (a Sigma cég állítja elő borjú bélből) adunk a restrikciós enzimes emésztéshez, majd 15 percig 37 °C-on inkubáljuk a reakciókeveréket. Ezt követi egy-két fenolos extrahálás, egy éteres extrakció és egy alkoholos kicsapás. Még mielőtt a további manipulációkat elvégeznénk, gyakran előfordul, hogy a DNS fragmentumokat még elektroforézissel elválasztjuk és a gélből eluáljuk. Hogy a nagy DNS fragmentumokat (500 bp hosszú, vagy ennél hosszabb) a kis fragmentumoktól (olyan linker fragmentumok ezek, amelyek nem kapcsolódtak, vagy kis restrikciós emésztési termékek) elválasszuk, izopropanolos kicsapást végzünk: a reakcióelegyhez 2 n ammónium-acetétot (vég-koncentráció) adunk, majd 0,6 térfogat izopropanollal 10-20 percig szobahőmérsékleten ki-, csapjuk. Az anyagot ezután Eppendorf centrifugában 5 percig centrifugáljuk, a felülúszót elöntjük, a csapadékot hideg 70%-os etanollal mossuk, majd újra centrifugáljuk; az itt keletkező üledéket szárítjuk és így a további feldolgozásra készen áll. B. AZ OLIGONUKLEOTIDOK ELŐÁLLÍTÁSA Jelmagyarázat: DMTr = p,p’-dimetoxi-trifenilmetil ibu = izobutiril bz = benzoil (a bázis nitrogénjén) = polimer hordozó B = timin vagy NMzobutiril-guanin vagy N4-benzoil-citozin vagy N6-benzoil-adenin THF = tetrahidrofurán I, példa A polimer hordozó működőképessé tétele A polimer hordozót a szakirodalomból ismert eljárással alakítjuk működőképessé. Hordozó anyagunk a HPLC-Silicagel (Macherey-Nagel gyártmány, szemcsenagyság 20 um, pórusnagyság 200 A°). A gélt Matteucci és Caruthers szerint kezeljük, azzal a különbséggel, hogy a borostyánkősav-anhidriddel való szukcinilezést vízmentes piridinben végezzük. [M. D. Matteucci, M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 21, 719 (1981); J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981) és T. Tanaka, R. L. Letsinger, Nucleic Acids Research, - 10, 3249 (1982)). A védett nukleozidok ennek megfelelően az I általános képlet szerint létesítenek kovalens kötést a szilikagéllel. A fedettség 68-104 jumól nukleozid hordozó grammonként. ' “Kis II. példa 5 - dime toxi tri til- d ezoxi timi din -3 ’-klórmetoxi-foszfit A teljesen védett nukleozid-3’-klór-metoxi-foszfitokat a szakirodalomból ismert eljárással szintetizáljuk [M. D. Matteucci, M. H. Caruthers, J. Am. chem. Soc. 103, 3185 (1981) és T. Tanaka, R. L. Letsinger, Nucleic Acids Research, 10, 3249 (1982)]. 544,6 mg (1,0 mmól) 5’-dimetoxi-tritil-timidint (DMTrdT) feloldunk 1,0 ml vízmentes THF-ben és ezt az oldatot -78 °C-on 15 percen belül, argon atmoszférában, cseppenként adagoljuk a 0,9 mmól metil-diklór-foszfitot tartalmazó 0,5 ml_ vízmentes piridinből és 2,0 ml vízmentes THF-ből álló oldathoz, keverés közben. További 10 perc eltelte után az oldatot szobahőmérsékletig melegítjük fel, majd lecentrifugáljuk. A felülúszót egy száraz, argonnal töltött 25 ml-es csiszolt-dugós lombikba pipettázzuk. Az oldószert szobahőmérsékleten, vákuum alatt elvonjuk, majd 0,5-0,5 ml toluolt és THF-et adunk az anyaghoz, majd újból bepároljuk és ekkor egy színtelen, habszerű szilárd anyag marad vissza. A terméket tisztaságára nézve nem 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
