202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
11 HU 202277 B 12 analizáltuk, hanem 10 ml vízmentes piridinben feloldottuk. Az oldatot argon alatt, -20 °C-on tartjuk el felhasználásig, azonban legfeljebb egy hétig. III. példa 5 ’-dimetoxi- tritil-tfi -izob u tiril-dezoxiguanozin-3 ’-klór-pietoxi-foszfit 10 Ezen nukleozid-foszforo-kloridit oldatát a II. példában leírtakkal analóg módon, 10,0 ml piridinben, 640,0 mg (1,0 mmól) 5’-dimetoxi-tritil-NMzobutil-dezoxiguanozinból 15 állítjuk elő. IV. példa 5 ’- dimetoxi- tri til-N4 - benzoil- dezoxiciti din-3 ’-klór-metoxi-foszfit 20 Ezen nukleozid-foszforo-kloridit oldatát a II. példában leírtakkal analóg módon, 25 10,0 ml piridinben, 633,7 mg (1,0 mmól) 5’-dimetoxi-tritil-N^-benzoil-dezoxiciticinből állítjuk eló. V. példa 5’-dime toxi- tri til-Ifi-benzoil- de zoxia denozin-3 ’-klór-metoxi-foszfit 35 Ezen nukleozid-foszforo-kloridit oldatát a II. példában leírtakkal analóg módon, 10,0 ml piridinben, 657,7 mg (1,0 mmól) 5’-dimetoxi-tritil-N6-benzoil-dezoxiadenozinból állítjuk elő. 40 VI, példa A d-TCCTTA szintetizálása 45 A DMTrdAb*-vel fedett polimer hordozó 50 mg-ját (=5 Mmól) üvegszűróbe töltjük. Ezután az alábbi felsorolásnak megfelelő sorrendben különböző oldószereket és reagense- 50 két öntünk hozzá, a hordozót ebben rövid ideig rázzuk, majd a kívánt reakció megtörténte után az oldatot újból eltávolítjuk úgy, hogy argon gáz segítségével (felülről) a zsugorított üvegszűrőn étnyomjuk. 55 a) a DMTr-csoport lehasitása 70 g cink-bromid, 500 ml nitrometán és 5 ml víz összetételű oldat 3 ml-ével. Reakció-idő: 10 perc. b) Mosás négyszer, minden alkalommal 3 ml n-butanol-lutidin-THF (4:1:5) elegyével. c) Mosás négyszer, minden alkalommal 4 ml vízmentes piridinnel. d) A következő nukleotid-épitókő rékondenzálása úgy történik, hogy körülbelül 100 pmól 5’-dimetoxi-tritil-dezoxitimidin-3’-klórmetoxi-fo8zfit (II. példa) piridines oldatának 1 ml-ét argon alatt az üvegszűrőben lévő polimer hordozóhoz adjuk, s a hordozót az oldatban felrázzuk. Reakció-idő: 10 perc. e) Mosás háromszor, alkalmanként 3 ml vízmentes piridinnel. f) A foszforsav-triészter oxidálásét 100 mg jóddal végezzük, melyet előzőleg THF, lutidin és víz (2:2:1) elegyének 3 ml-ében oldottunk fel. Reakció-idő: 7 perc. g) Mosás háromszor, minden alkalommal 4 ml THF-el. h) A nem reagált 5'-hidroxil csoportok acetilezése a következő összetételű oldattal történik: 150 mg 4-dimetil-amino-piridin, 0,3 ml kollidin, 0,25 ml ecetsavanhidrid és 2,5 ml THF. Reakció-idő: 5 perc. i) Mosás négyszer, mindig 3-3 ml nitrometánnal. Az a)-i) ciklust még négyszer ismételjük és minden alkalommal a d) lépésnél a szekvenciához éppen szükséges nukleotid építőkövet használjuk. A kitermelés meghatározása: Az utolsó nukleotid építőkő kondenzáltatása után a hordozót olajszivattyúval létesített vákuumban szárítjuk, körülbelül 1 mg mintát pontosan lemérünk belőle és hozzáadunk 10,0 ml-t 0,1 mólos toluol-szulfonsav acetonitriles oldatából. Ekkor leválik a dimetoxi-tritil-kation, s így egy narancs-vörös oldatot kapunk, melynek az abszorpcióját 498 nm-en mérjük. Az alábbi képlet szerint számítjuk ki a hordozó dimetoxi-tritil-csoportokkal való fedettségét: Fedettség [pmol/g] = (Absz.498)-( higitási faktor)-14,3 a hordozó súlya (mg) 8
