202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
23 HU 202277 B 24 maradék, nem hasított pER 33-tól megtisztítjuk. A DNS-t fenollal és éterrel extraháljuk, etanolos oldatból kicsapjuk és 10 pl vizben oldjuk. c) A linearizált pER 33 összekapcsolása a hozzáadott IFN-oCA génnel IFN-oC^ gént és regulációs elemeket tartalmazó Eco RI-linkerrel ellátott DNS-darab tartalmú 4 pl-nyi oldathoz hozzáadunk 0,5 pl Eco Rl-el linearizált és defoszforilált pER 33- -at 20 pl-nyi reakció közegben és a molekulákat 0,1 egység T4 ligáz segítségével egymással összekapcsoljuk. A reakcióelegyet 16 órán át 14 °C-on inkubáljuk, majd az enzimet 68 °C-ra történő hevítéssel elbontjuk. d) E. coli HB 101 transzformálása és a transzformáció vizsgálata interferon termelés szem pon tjá ból E. coli HB 101 sejteket az le. példában leírtak szerint a 3c. példa DNS-ével transzformálunk. Két ilyen módon előállított klón interferon expresszióját a 2d. példához analóg módon plakk-redukciós módszerrel megvizsgáltunk. Mig a pER 33 klón 200x10® egység IFN-t termel tenyészet literenként, addig az új kiónok egyike - pER 21/1 a jele - meglepő módon több mint 300x10® egységet termelt tenyészet literenként. Az interferont ismert módszerekkel nyerjük ki, és tisztítjuk [lásd 2.d) példánál]. e) A pER 21/1 restrikciós enzimes vizsgálata A pER 21/1 plazmidot nagyobb mennyiségben izoláltuk és HindlII restrikciós enzimmel történő emésztés segítségével analizáltuk. Minthogy a pER 33-ban az Eco Rí helyre bevitt DNS-nek két azonos Eco Rí vége van, e DNS-nek két lehetséges iránya lehet a pER 21/1-ben. Parellel irányú interferon génnel rendelkező pER 21/1 HindlII restrikciós enzimes emésztésekor 4100, 950 (két fragmentum) és 450 bp körülbelüli nagyságú fragmentumoknak kell keletkezniük. Amennyiben a két gén ellentétes irányú, a várható fragmentumok hozzávetőleges nagysága 4350, 950 (két fragmentum) és 200 bp lesz. A pER 21/1 plazmid 2 pg-ját HindlII restrikciós enzimmel emésztve, majd ezt követően 1,4X-os agaróz gélben elektroforézissel elválasztva, olyan fragmentumok keletkeztek, melyek körülbelül 4100, 950 és 450 bp nagyságúak voltak. Ebből következett, hogy mindkét IFN-oCA gén iránya egymáshoz képest párhuzamos volt (lásd a 6. ábrát). 14 A parpER 33 interferon termelő plazmid szerkesztése A parpER 33 plazmid szerkesztésének sémáját a 7. ébrén mutatjuk be. 4. példa a) a par-lokusz előállítása Körülbelül 200 pmól Eco Rí linkért (New England 'Biolabs Inc.) 20 pl reakció-közegben 9 egység T4 polinukleotid kinázzal és 10 nmól ATP-vel a végein foszforilálunk, majd ezután az enzimet hővel inaktiváljuk. A pPM 31 plazmid 8 pg-jét Ava I restrikciós enzimmel hasítjuk. A linearizált plazmid végeit egyenként 5 nmól dATP, dGTP, dTTP, valamint 4 egység Klenow fragment (polimeréz I) hozzáadáséval tompa végekké (blunt-end) alakítjuk. A DNS-t fenollal extraháljuk, etanolos oldatból kicsapjuk és 40 pl vizben felvesszük. Az Eco Rí linkért a linearizált tompa végeket mutató DNS-el együtt 70 pl reakció térfogatban 6 nmól ATP-vel és 1 egység T4 ligázzal 16 órán át 14 °C-on kezeljük. Az enzim hódenaturálása után az oldatot 50 nmól nátrium-klorid é6 50 nmól trisz-sósav hozzáadásával pH=7,6 értékre állítjuk be, majd a DNS-t 300 egység Eco Rl-el kezeljük. Két órai inkubálás után a restrikciós enzimet hővel denaturáljuk és a DNS-t 1,4%-os agaróz gélben elektroforézissel elválasztjuk. A par-lokuszt tartalmazó mintegy 400 bp hosszúságú DNS darabot a gélből elektroforézissel eluáljuk, fenolos extrahálással és etanolos oldatból történő kicsapással tisztítjuk, majd 50 pl vizben feloldjuk. Ez a DNS darab Eco RI-specifikus túlnyúló végeket hordoz. b) A pER 33 plazmid linearizálása A pER 33 plazmid 2 pg-ját Eco Rí restrikciós enzimmel kezeljük. Ezt követően alkalikus foszfatázt adunk hozzá az 5'-foszfát csoport eltávolítása céljából. A körülbelül 5300 bp hosszú, lineáris DNS-t 1,2%-os agaróz gél-elektroforézissel, majd elektro-elúcióval a maradók, nem hasított pER 33-tól megtisztítjuk. A DNS oldatot fenollal és éterrel extraháljuk, etanolos oldatból kicsapjuk, majd 50 pl vizben feloldjuk. c) A linearizált pER 33 összekapcsolása a par-lokusz DNS-el 1 pl linearizált pER 33 DNS-t 1 pl par-lokusz DNS-el 0,1 egység T4 ligáz segítségével 20 pl reakció-térfogatban egymáshoz kapcsolunk. A reakcióelegyet 16 órán át 14 °C-on inkubáljuk, majd az enzimet hővel inaktiváljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
