202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez

25

HU 202277 B

26

d) Az E. coli HB 101 transzformálása és a cDNS:

transzformált baktériumokból származó plazmidok vizsgálata Kódolni:

E. coli HB 101 sejteket az le. példában 5 leírtakkal analóg módon transzformálunk a 4c. példában szereplő DNS-el. Körülbelül 50 telepet kaptunk. Tiz telepből kismennyiségű plazmid DNS-t izoláltunk [Bimbóim és Doly,

Nucleic Acid. Research, 7, 1513-1523 (1979)], 10 amelyet Pst I-restrikciós enzimmel hasitot- Kodon: tunk. Az agaróz gél elektroforézis eredménye azt mutatta, hogy mindezen plazmid tartalmazta a körülbelül 400 bp hosszú par-lokuszt. Közülük egy plazmidot kiválasztottunk 15 és parpER 33-al jelöltünk.

e) A parpER 33 vizsgálata interferon termelés és stabilitás szempontjából

A 2d. példában leírtakkal analóg módon pER 33 és parpER 33 tartalmú baktérium sejteket tenyésztettünk, majd plakk-redukciós módszerrel interferon tartalomra vizsgáltunk. Mindkét törzs körülbelül ugyanazon nívójú interferon expressziót mutatott. Az interferont a 2d és 3d példáknál említett módon nyerjük ki, ób tisztítjuk.

Egy hosszantartó vizsgálatban, amely 120 baktérium generáción keresztül húzódott, a pER 33 és parpER 33 plazmid stabilitását vizsgáltuk meg az ampicillin (antibiotikum) által gyakorolt szelekciós kényszer nélkül. Egyenlő időközönként a tenyészetekből mintát vettünk és a baktériumokat interferon tartalomra vizsgáltuk. Kiderült, hogy a pER 33 tartalmú baktériumok körülbelül a 60. generáció után az interferon termelést abbahagyták. A parpER 33-at tartalmazó baktériumsejtek még a 120. generáció után is csökkenés nélkül termeltek oCA interferont.

így bizonyítottuk, hogy a par-lokusz bevitele a pER 33-ba (.parpER 33') a plazmid stabilitását az E. coli HB 101 törzsben megnöveli.

Defoszforiláias:

20 DNS:

DTT:

Elektroforézis:

25 Expresszió= =kifejezódés:

30

Expressziós plazmid: 35

Gén:

40

Géntermék:

HASZNÁLT FOGALMAK ÉS RÖVIDÍTÉSEK

ATP:

Bázispár:

Blunt-end (tompa vég):

Bp:

BSA:

adenozintrifoszfát két komplementer nukleotid, például A-T, G-C

kétszálú DNS molekula vége, ahol pór nélküli bázis nincs, megkülönböztetésül az egyszálú, túllógó végektől bázispár

marha szérum albumin

Hibridizálás

(nukleinsavaké):

Hibrid plazmid:

IFN-oCA:

Iniciációs kodon:

60

Inszertum:

mRNS-el komplementer DNS

információt hordozni valamire nézve; a DNS nukleotid szekvenciájában hordozza egy protein aminosav szekvenciájára vonatkozó információt

három nukleotidból álló csoport, amely egy meghatározott aminoBavat, vagy pedig a polipeptid szintézis megszakítását kódolja foszfát csoportot eltávolítani

dezoxiribonukleinsav

ditiotreitol

(DNS-)molekulák elválasztása elektromos térben

egy gén információjának átváltoztatása mRNS-é transzkripció által és ezt követően polipeptlddé transzláció révén plazmid, amely a beépített (inszertált) gén kifejeződését (expresszióját) lehetővé teszi

a DNS-en egy olyan szakasz, amely egy meghatározott RNS molekula információját hordozza és ez a következőkben proteinné fordítható át RNS (transzkripciós termék),

protein (transzlációs termék)

egymással komplementer DNS-szálak közti stabil komplexek létrehozása plazmid, amely idegen eredetű DNS szakaszt tartalmaz a leukocita interferon A szubtipusa az ATG kodon, amely a metionint kódolja és a transzláció kezdetéhez adhat jelt idegen DNS darab, amely egy hibrid plazmidban van jelen

15