202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
15 HU 202275 A 16 aminosav törlése, helyettesítése, beillesztése vagy inverziója folytén, például egy adott DNS helyre irányuló mutagenezise következtében. Emellett a humán Vili. faktor töredékei, akár in vivo, akár in vitro képződtek, rendelkezhetnek a szükséges hasznos aktivitással, amint azt fentebb már kifejtettük. Valamennyi ilyen alléi változat, glikozilezett változat, módosítás és töredék, amely a Vili. faktor származékait eredményezi, a találmány körébe tartozik, amennyiben tartalmazza a humán Vili. faktor működőképes szegmensét, és megmarad az elengedhetetlen, a humán VIII. faktorral jellemző működési aktivitás. Ezeket a működőképes változatokat vagy módosított származékokat .humán VIII. faktor származékok"-nak nevezzük. Azokat a VIII. faktor származékokat, amelyek rendelkeznek a szükséges működőképes aktivitással, könnyen azonosíthatjuk in vitro vizsgálatokkal, amelyeket a későbbiek során ismertetünk. A humán VIII. faktor DNS szekvenciájának általunk történő leírása és a humán VIII. faktor aminosav-szekvenciájának ismerete alapján a szakember számára nyilvánvaló, hogy milyen töredékek állíthatók elő a DNS restrikciós enzimmel történő elhasításával vagy a humán VIII. faktor fehérjének proteolitikus vagy másmilyen elbontásával. A működőképes alakban jelenlevő humán VIII, faktor" képes arra, hogy katalizálja a X. faktor Xa. faktorrá történő átalakulásét a faktor Xa. faktorrá történő átalakulását a IXa. faktor, kalcium és foszfolipid jelenlétében. Képes továbbá arra, hogy korrigálja az A. típusú vérzékenységben szenvedő betegektől vett vérplazmában fennálló véralvadási fogyatékosságot. Az immunológiai tulajdonságai alapján is azonosítható vagy lényegében azonosítható az emberi vérplazmában jelenlevő VIII. faktorral. Amikor a találmány szerint előállított humán VIII. faktor állapotát úgy jellemezzük, hogy .lényegében tiszta alak’-ban van jelen, ezen azt értjük, hogy gyakorlatilag mentes azoktól a fehérjéktől vagy egyéb anyagoktól, amelyek rendszerint a VIII. faktort kísérik, amikor azt nem rekombináns forrásokból különítjük el, azaz a .natív", vérplazma-tartalmú környezetből különítjük el. .DHFR fehérjén" olyan fehérjét értünk, amely rendelkezik a dihidrofolát reduktázzal (DHFR) kapcsolatos aktivitással, és amelyet ezért olyan sejteknek kell termelniük, amelyek képesek a túlélésre hipoxantinban, glicinben és timidinben hiányos táptalajon (-HGT táptalajon). Általában azok a sejtek, amelyekből hiányzik a DHFR fehérje, képtelenek a növekedésre ezen a táptalajon. A DHFR-tartalmú sejtek viszont növekednek az ilyen táptalajon. .Kifejező vektro"-on olyan vektorokat értünk, amelyek képesek a bennük jelenlevő DNS szekvenciák kifejezésére, ha ezeket a szekvenciákat működőképesen összekapcsoljuk más olyan szekvenciákkal, amelyek képesek a kifejezés végrehajtására. Ezek a kifejező vektorok replikálódnak a gazdasejtben, vagy egy ép, működőképes replikációs origó segítségével, vagy a sejtkromoszómába történő működőképes beépülés hatására. A kifejező vektor funkcionális definíciót is kaphat; minden olyan DNS szekvencia, amely képes egy benne lévő adott DNS kód hatékony kifejezésére, beleértendő ebbe a kifejezésbe. Általában a rekombináns technikáknál használt kifejező vektorok gyakran plazmidok alakjában vannak jelen, amelyek kör alakú, kettős szálú hurkok. A találmány azonban a kifejzó vektorok más olyan formáira is kiterjed, amelyek egyenértékű feladatokat látnak el. .DNS izolátum" kifejezésen azt a DNS szekvenciát értjük, amely a humán VIII. faktort kódoló szekvenciát tartalmazza, akár önmagában, akár egy klónozó vektorba beépítve. A .rekombináns gazdasejt' kifejezés olyan sejtre/sejtekre vonatkozik, amelyet/amelyeket rekombináns DNS tecnikákkal kialakított vektorokkal transzformálunk. Amint arra utalunk, a VIII. faktor vagy annak működőképes részei e transzformáció segítségével jelentős mennyiségben képződnek, szemben a kisebb termeléssel és csekélyebb mértékű tisztasággal, amely egy transzformálatlan, természetes eredetű gazdasejt segítségével érhető el. Az ilyenfajta rekombináns gazdasejt által termelt VIII. faktort rekombináns humán VIII. faktornak is nevezhetjük. A DNS és RNS méretére vonatkozó egységeket gyakran a következőképpen rövidítjük: b=bázis vagy bázispár, kb=kilo (ezer) bázis vagy kilobázispár. Fehérjékre vonatkozólag D=Dalton, kD=kiloDalton. A hőmérséklet-értékek mindig °C-ban vannak megadva. B. Gazdasejt-tenyészetek és vektorok A találmány szerint sokféle rekombináns gazdasejtben termelhetünk értékes rekombináns humán VIII. faktort. Az alábbiakban egy különösen előnyős rendszert ismertetünk. Általában a prokarióták előnyösen a DNS szekvenciák klónozásához a találmány szerint alkalmazott vektorok létrehozásához. Például különösen előnyös az Escherichia coli K12 294 törzs (ATCC 31446). Más használható mikrobiális törzsek a következők: Escherichia coli törzsek, például Escherichia coli B és Escherichia coli xl776 (ATCC 31537) és Eschericia coli c600 és cBOOhfl, Escherichia coli W3110 (F", lambda*, prototróf, ATCC 27325), Bacillusok, például Bacillus subtilis és más Enterobacteriaceae törzsek, például Salmonella typhiniurium vagy Serratia marcesceris, valamint különféle Pseudomonas fajták. A felsorolt példák természetesen semmiképpen nem korlátozzák a szóba jövő törzsek 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
