202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
17 HU 202275 A 18 körét, csak szemléltetésül szolgálnak. Általában ezekhez a gazdasejtekhez olyan plazmidvektorokat használunk, amelyek replikon és szabályozó szekvenciákat tartalmaznak; ezek a gazdasejtekkel összeférhető sejtekből származnak. A vektor rendszerint hordoz egy replikációs helyet, valamint jelzöszekvenciákat, amelyek képesek a transzformáit sejtek közül a fenotipus kiválasztására. Például az Escherichia coli törzseket többnyire pBR322 plazmiddal transzformáljuk. Ez a plazmid egy Escherichia coli fajból származik [Bolivar és munkatársai, Gene, 2, 95 (1977)]. A pBR322 plazmid az ampicillinnel és tetraciklinnel szembeni rezisztenciát biztosító géneket tartalmaz, és ezáltal könnyen azonosíthatók és kiválaszthatók a transzformált sejtek. A pBR322 plazmidnak vagy más mikrobiális plazmidnak olyan promotorokat is tartalmaznia kell - vagy úgy kell módosítani, hogy tartalmazzon -, amelyeket a mikroorganizmus felhasználhat a saját fehérjéinek a kifejezésére. A rekombináns DNS kialakításához leggyakrabban használt promotorok a béta-laktamáz (penicillináz) és laktóz promotor rendszerek [Chang és munkatársai, Nature, 275, 615 (1978); Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1977); Goeddel és munkatársai, Nature, 281, 544 (1979)], valamint egy triptofán (trp) promoter rendszer [Goeddel és munkatársai, Nucleic Acid Res., 8, 4057 (1980); 0036776 sz. publikált európai szabadalmi bejelentés]. Bár ezek a leggyakrabban alkalmazott promoter rendszerek, más mikrobiális promotorokat is felfedeztek és hasznosítottak, s ezek nukleotid szekvenciával kapcsolatos részleteket publikálták. Így a szakember számára lehetővé vált, hogy működőképesen ligálja ezeket plazmid vektorokkal [Siebenlist és munkatársai, Cell, 20, 269 (1980)]. A prokariótákon kívül eukarióta mikrobák, például élesztótenyészetek is használhatók. A Saccharomyces cerevisiae vagy közönséges sütőipari élesztő a leggyakrabban használt az eukarióta mikroorganizmusok közül, jóllehet több más törzs is rendelkezésre áll. A Saccharomyces törzsekben történő kifejezéshez például az YRp7 plazmidot használják [Stinchcomb és munkatársai, Nature, 282, 39 (1979); Kingsman és munkatársai, Gene, 7, 141 (1979); Tschemper és munkatársai, Gene, 10, 157 (1980)]. Ez a plazmid már tartalmazza trpl gént, amely szelekciós markert biztosit egy olyan mutáns élesztötörzs számára, amelyből hiányzik a triptofánban való növekedés képessége. Ilyen törzs például az ATCC 44076 vagy PEP4-1 [Jones, Genetics, 85, 12 (1977)]. A trpl rendellenesség jelenléte, mint az élesztő gazdasejt genom jellemzője igy hatékony környezetet biztosít a transzformáció kimutatásához a triptofán távollétében történő növekedés révén. Alkalmas promoter szekvenciák az élesz- Ló vektorokban a 3-foszfo-glicerát-kinázhoz tartozó promotorok [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 2073 (1980)], vagy más glikolítikus enzimekhez tartozó promotorok [Hess és munkatársai, J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149 (1968); Holland és munkatársai, Biochemistry, 17, 4900 (1978), mint amilyenek például a következők: enoláz, gliceraldehid-3-foszfót dehidrogenáz, hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glukóz-6- -foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerát mutéz, piruvátkináz, Lriózfoszfót izomeráz, foszfoglukóz izomeráz és glukokináz. Az alkalmas kifejező plazmidok kialakításakor az ezekhez a génekhez tartozó terminációs szekvenciákat is ligáljuk a kifejező vektorhoz, a kifejezni kívánt szekvencia 3’ végéhez, hogy biztosítsuk az mRNS poliadenilezését és a terminációt. Más promotorok, amelyeknek az a további előnye, hogy az átírást a növekedési feltételek szabályozzák, a következők: promoter tartományok az alkohol dehidrogenáz 2, izocitokróm C, savas foszfatáz enzimekhez, a nitrogén-anyagcserével kapcsolatos bontóenzimekhez, a fentebb említett glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenázhoz, valamint a maltóz és galaktóz hasznosításáért felelős enzimekhez. Minden olyan plazmidvektor alkalmas, amely az élesztővel összeférhető promotort, replikációs origót és terminációs szekvenciákat tartalmaz. Gazdasejtként előnyösen többsejtű szervezetektől származó sejtek tenyészetét használjuk, különösen a találmány szerinti működőképes humán Vili. faktor termelésére szolgáló DNS kifejezésére. Általában a gerincesekből származó sejtek különösen érdekesek, például a VERŐ és HeLa sejtek, a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonalak, továbbá a W138, BHK, COS-7 és MDCK sejtvonalak. A kifejező vektorok az ilyen sejtek számára rendszerint tartalmaznak - ha szükséges - egy vagy több replikációs origót, a kifejezni kívánt gén előtt elhelyezkedő promotort a szükséges riboszóma kötési helyekkel, RNS összefonódási helyekkel, poliadenilezési helyekkel és átíráslezáró szekvenciákkal együtt. Az emlősöktől származó sejtekben történő alkalmazásnál a kifejező vektorokon lévő szabályozó funkciókat vírusos eredetű anyag biztosíthatja. Például szokásosan alkalmazott promotorok származnak a poliomából, a Simian Virus 40 (SV40)-böl és különösen az adenovirus 2-ből. Az SV40 virus korai és késői promotorai hasznosak, akárcsak az adenovirus fő késői promotora, amelyet fentebb említettünk. Az is lehetséges és gyakran kívánatos továbbá, hogy a kívánt gén szekvenciával általában táisult promoter vagy szabályozó szekvenciákat használjuk fel, feltéve, hogy ezek a szabályozó szekvenciák összeférhetök a gazdasejt rendszerrel. 5 10 15 20 25 30 35 40 15 50 55 60 05 11
