202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
63 HU 202275 A 64 Egy sor Escherichia coli (Vili. faktor .fúziós fehérjét" állítunk elő erre a célra. A VIII. faktor kiónjainak töredékeit ligáljuk a pNCV plazmid [Kleid és munkatársai, Science, 214, 1125 (1981)] BglII helyébe oly módon, hogy egyesítsük a VIII. faktort kódoló szekvenciákat, megfelelő leolvasókeretben, a fuzionált Escherichia coli trp LE fehérje első 12 aminosavjával [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Kleid és munkatársai, Science, 214, 1125 (1981); Goeddel és munkatársai, Nature, 287, 411 (1980)]. Ebből az erős trp promotor rendszerből rendszerint jelentős mennyiségű rekombináns fehérje termék képződik. Pfusl-et állítunk elő oly módon, hogy elkülönítjük a VIII. faktor 189 bázispárból álló StuI/HincII töredékét (amely az 1799- -1860. számú aminosavakat kódolja), majd ligáljuk ezt a pUC13 Smal helyébe [Norrander és munkatársai, Gene, 26, 101 (1983)]. A kapott közbülső plazmidot emésztjük BamllI és EcoRI enzimekkel, a 200 bázispárból álló töredéket pedig beillesztjük pNCV-be [Kleid és munkatársai, Science, 214, 1125 (1981)], amelyből előzőleg eltávolítottuk az 526 bázispárból álló, BglII és EcoRI közötti töredéket. Ez a pfusl plazmid a trp promotor irányítása mellett egy 10 kD nagyságú fúziós fehérjét termel, amely a trpLE és a kapcsoló által kódolt 16 aminosavból, majd a VIII. faktor 61 maradékából, végül a kapcsoló által kódolt maradékból és trpE karboxi terminális 9 maradékból áll. A pfus3 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy eltávolítjuk a VIII. faktor egy 290 bázispárból álló Avail töredékét (1000-1096. aminosav), betöltjük a túlnyúló nukleotidokat a DNS polimeráz Klenow töredékének alkalmazásával, és ligáljuk ezt már tompa végű DNS töredéket pNCV-be, amelyet előzetesen elhasitottunk BglII enzimmel, és hasonló módon betöltöttünk. Ez a plazmid - a betöltött töredékkel a megfelelő orientációban, amint azt restrikciós enzimes emésztéssel és DNS-szekvencia analízissel meghatározzuk - irányítja egy közelítőleg 40 kD molekulatömegű fúziós fehérje szintézisét. Ez a fehérje a VIII. faktor 97 aminosavját tartalmazza, beágyazva a 192 aminosavból álló trpLE fehérjébe. A pfus4 plazmid előállítására a lambda 222.8 nevű Vili. faktor alklónt hasítunk Báni enzimmel, leemésztjük a túlnyúló részt Sí nukleáz segítségével, majd emésztést végzünk PstI enzimmel, és elkülönítjük a kapott, 525 bázispárból álló, tompa végű PstI töredéket (710-885. aminosav). Ezt ligáljuk pNCV-be, amelyet előzetesen emésztettünk BglII enzimmel, Sí nukleázzal kezeltünk, PstI enzimmel emésztettünk, és a vektor-töredéket elkülönítettük. A pfus4 plazmid irányítja agy 22 kD nagyságú fúziós fehérje szintézisét. Ez a fehérje a VIII. faktor 175 aminosavját tartalmazza a trpLE kezdeti 12 aminosavja után. 34 A fúziós fehérjéket tisztítás után nyulakba fecskendezzük, hogy antitesteket hozzunk létre a fentebb ismertetett módon. Ezeket az antitesteket Western foltanalizissel vizsgáljuk át a plazma eredetű VIII. faktor megkötésére vonatkozólag. Egy ilyen Western átvitel eredményét a 13. ábrán mutatjuk be. A fúziós fehérjék mindegyike reakcióba lép a plazmában lévő Vili. faktorral. Az 1. fúziós fehérjét a génnek abból a részéből alakítjuk ki, amely egy 80.000 dalton molekulatömegű polipeptidet kódol. Látható, hogy az 1. fúziós fehérje antiszéruma csak a 80.000 dalton molekulatömegű sávval reagál, és nem lép reakcióba a nagyobb molekulatömegű fehérjékkel. A 3. és 4. fúziós fehérje antiszéruma kereszt-reakcióképességet mutat a 80.000 daltonnál nagyobb molekulatomégü fehérjékkel, nem lép reakcióba viszont a 80.000 dalton mole ku latomé gű sávval. A C8 monoklonális antitest aktivitást semlegesítő monoklonális antitest, amely a VIII. faktorra irányul, és ismeretes, hogy reakcióba lép a 210.000 dalton molekulatömegű fehérjével. A 14. ábra azt mutatja be, hogy a 4. fúziós fehérje reakcióba lép ezzel a monoklonális antitesttel, jelezve, ezáltal, hogy a C8 monoklonális antitest által felismert aminosavszekvenciát a 4. fúziós polipeptid kódolja. Ez még inkább alátámasztja a 4. fúziós fehérjét tartalmazó fehérje azonosságát a 210.000 dalton molekulatömegű fehérjével. A fenti vizsgálatok igazolják, hogy a gén kódolja mind a 210.000 dalton molekulatömegű, mind a 80.000 dalton inolekulatömegű fehérjék aminosav-szekvenciáját. 11. Gyógyászati készítmények A jelen találmány szerinti vegyületeket önmagukban ismert módszerekkel gyógyászati készítményekké alakíthatjuk. Ennek során a találmány szerinti humán VIII. faktort egy vagy több gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal keverjük össze. Az alkalmas vivőanyagokat és gyógyászati készítmények kikészítését más humán fehérjéknél, például a humán szérum albuminnál a következő kézikönyv ismerteti: Remington’s Pharmaceutical Sciences, szerkesztő Martin E.W. A gyógyászati készítmények hatékony mennyiségű találmány szerinti fehérjét tartalmaznak, alkalmas mennyiségű, a gyógyszerkészitésnél szokásosan használt vivőanyaggal együtt. A találmány szerinti humán VIII. faktort beadhatjuk például parentálisan olyan betegeknek, akik például A. haemofdiában szenvednek. A vérzékenységben szenvedő betegek kezelésénél alkalmazott átlagos dózis függ a vérzés súlyosságától. Az intravénásán beadott átlagos dózis a következő: 40 egység/kg operáció előtti esetekben; 15-20 egység/kg kisebb vérzéseknél; és 20-40 egység/kg 8 órán át beadva fenntartó dózisként. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
