202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
65 HU 202275 A 66 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás humán VIII. faktort, vagy annak legfeljebb 10%-ban eltérő, de még VIII. faktor hatású származékát kódoló nukleinsav-szekvencia előállítására természetes forrásból, azzal jellemezve, hogy 1., valamely VIII. faktor mRNS forrást azonosítunk; 2., az mRNS-böl cDNS könyvtárat készítünk; 3., a könyvtárat átvizsgáljuk VIII. faktor részeit kódoló kiónokra; 4., humán lambda és kozmid könyvtárakat létesítünk és vizsgálunk át VIII. faktor részeit kódoló kiónokra; 5., a VIII. faktort kódoló nukleinsavak 5’ és 3’ végeinek azonosítására vizsgálómintákat alkalmazunk; 6., pozitív kiónokat izolálunk és térképezünk fel; és 7., pozitív átfedő és szomszédos genomikus és cDNS klónokból fragmentumokat ligálunk össze, Így állítva össze a teljes humán VIII. faktor fehérjét vagy származékot kódoló nukleinsav-szekvenciát. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kozmid könyvtár létesítéséhez pGcos4 kozmidot alkalmazunk. 3. Eljárás humán VIII. faktort vagy ennek legfeljebb 10%-ban eltérő, de még VIII. faktor hatású származékát kódoló kifejező vektor előállítására azzal jellemezve, hogy 1., szabályozó elemeket és más kifejező vektor elemeket tartalmazó egy vagy több vektort restrikciós enzimekkel elhasitunk, izoláljuk a szabályozó- és más vektro-elemeket tartalmazó nukleinsav fragmentumo(ka)t; és 2., a lineáris nukleinsav vektor fragmentumot kait ligáljuk olyan, a humán VIII. faktort vagy származékát kódoló nukleinsavval, amely végein megfelelően illeszkedő restrikciós helyekkel bir. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy vektor fragmentumkét adenovirus késői fő promotort, háromrészes vezető szekvenciát és DHFR-t kódoló DNS-t tartalmazó fragmentumot alkalmazunk. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás a pAML3P. 8cl kifejező vektor előállítására azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. 6. Eljárás humán Vili. faktort vagy annak legfeljebb 10%-ban eltérő, de még VIII. faktor hatású származékát termelő eukarióta gazdasejt előállítására azzal jellemezve, hogy eukarióta sejteket a., valamely 3. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk, vagy b., együLt transzformálunk valamely 4. igénypont szerint előállított vektorral és valamely szelektálható markert tartalmazó vektorral, a transzformáláshoz mindkét esetben előnyösen kalcium-foszfátos kicsapást, sejtbe injekciót vagy protoplaszt-fúziót alkalmazva. 7. A 6. igénypont szerinti b., eljárás azzal jellemezve, hogy szelektálható markéiként neomicin rezisztenciával bíró vektorral transzformálunk. 8., A 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy eukarióta sejtként emlős sejteket alkalmazunk. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy emlős sejtként újszülött hörcsög vese (BHK) sejtvonalat alkalmazunk. 10. Eljárás szennyező fehérjéktől és vírusoktól mentes humán VIII. faktor vagy annak legfeljebb 10%-ban eltérő, de még VIII. faktor hatású származéka előállítására azzal jellemezve, hugi' a. 1. valamely eukarióta gazdasejtet valamely 3. igénypont szerinti eljárással előállított vektorral transzformálunk, előnyösen kalcium-foszfátos kicsapóst, sejtbe injektálást vagy protoplaszt-fúziót. alkalmazva; 2. a sejteket tenyésztjük; és 3. a VIII. faktort vagy származékát a tenyészetből kinyerjük; vagy b. 1., valamely eukarióta gazdasejtet együtt transzformálunk valamely 4. igénypont szerinti eljárással előállított vektorral és egy valamely szelektálható markért tartalmazó vektorral, előnyösen kalcium-foszfátos kicsapást, sejtbe injektálást vagy protoplaszt-fúziót alkalmazva; 2. a szelektálható markert tartalmazó sejteket szelektáljuk; 3. a DHFR-t kódoló DNS-t tartalmazó sejtek DNS-ét sokszorozzuk; 4. a kiválasztott és DNS-ében sokszorozott sejteket tenyésztjük; és 5. a VIII. faktort vagy származékát a tenyészetből kinyerjük. 11. A 10. igénypont szerinti b., eljárás azzal jellemezve, hogy szelektálható markerként neomicin rezisztenciával biró vektorral transzformálunk és a szelekciót a szelektálható markerral úgy végezzük, hogy G418 antibiotikumot adunk a tenyésztő tápkózeghez. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy gazdasejtként újszülött hörcsög vese (BHK) sejtvonalat alkalmazunk. 13. Eljárás szennyező fehérjéktől és vírusoktól mentes humán VIII. faktor hatású gyógyszerkészítmények elöállitásóra azzal jellemezve, hogy valamely 10. igénypont sze-35 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
