202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
61 HU 202275 A 62 nye, hogy a trombin aktiválja a VIII. faktort. A trombin hatására fellépő, közelítőleg 20- -szoros aktiválás jól egyezik a plazmában lévő VIII. faktorra megfigyelt értékkel. f. A rekombináns VIII. faktor megkötése Sepharose gyantához kapcsolt von Willebrand faktoron Ismeretes, hogy a VIII. faktor a von Killebrand faktorral (vWF) képzett reverzibilis komplex alakjában kering a vérplazmában [Thelin és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 95, 70 (1961); Griggs és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 70, 2814 (1973); Donáti és munkatársai, Thromb. Rés., 2, 97 (1973); Weiss és munkatársai, Br.J. Haematol., 18, 89 (1970; Weiss és munkatársai, Thromb. Diath. Haemorrh., 27, 212 (1972); Weiss és munkatársai, Science, 182, 1149 (1973); Rick és munkatársai, Blood, 42, 737 (1973); Rick és munkatársai, Thromb. Rés., 7, 909 (1975); Thelin és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 95, 70 (1961); Owen és munkatársai, Thromb. Diath. Haemorrh., 27, 502 (1972); Cooper és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 70, 2326 (1973). Ezért a rekombináns VIII. faktor használható formájának szintén rendelkeznie kell azzal a képességgel, hogy ilyen komplexet képezzen. Ezzel megerősíthetjük az előállított VIII. faktor azonosságát. Ezen túlmenően, ez a komplexképző képesség bizonyítja a rekombináns VIII. faktornak azon képességét, hogy a VIII. faktor természetes, vérben áramló aktiv formáját hozza létre és hemofíliás betegek vérébe történő infúzió után a von Willebrand faktorral komplexet képez. Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk a rekombináns VIII. faktort, a von Willebrand faktorral történő kölcsönhatásra, a von Willebrand faktort megtisztítjuk és gyantához kötjük a következőképpen; Humán Vili. faktor koncentrátumokat (amelyeket például a Cutter Laboratories cégtől szerezhetünk be) Sepharose CL4B gyantán kromatografálunk, a humán von Willebrand faktor előállítása érdekében. A gyantát előzetesen egyensúlyba hozzuk 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó 0,05 M trisz-oldattal, pH=7,3. A von Willebrand faktor az oszlop üres térfogatában eluálódik. Ezt a részt egyesítjük, 40% ammónium-szulfát-koncentráció beállításával kicsapva töményitjük, és ismét kromatografáljuk az oszlopon a fenti puffer-oldat jelenlétében, amely 0,25 M kalcium-kloridot is tartalmaz. Ilyen módon elválasztjuk a VIII. faktornak megfelelő véralvasztó aktivitást a von Willebrand faktortól. Az üres térfogatnak megfelelő frakciókat ismét egyesítjük, ammónium-szulfát hozzáadásával koncentráljuk, és 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal szemben dializáljuk. A kapott készítményt kovalens kötéssel hozzákapcsoljuk cianogén-bromiddal aktivált Sepharose gyantához (amelyet a Pharmacia cégtől szerzünk be), a gyártó által ajánlott módon. Az oszlopot 0,05 M nátrium-kloridot és 0,25 M kalcium-kloridot tartalmazó 0,02 M trisz-oldattal (pll=7,3) mossuk a gyantához nem kötődő fehérjék eltávolításéra. A rekombináns Vili. faktort szérumtól mentes közegben állítjuk elő, és szobahőmérsékleten viszszük fel a von Willebrand faktort tartalmazó gyanta 0,1 ml térfogatú oszlopára. Az oszlopot mossuk a nem kötődő fehérje eltávolítására, majd eluáljuk. Ehhez a következő oldatot használjuk: 0,02 M trisz-oldat, pH=7,3, amely 0,05 M nátrium-kloridot és 0,25 M kalcium-kloridot tartalmaz. 1,0 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk, 1:1 arányban hígítjuk, és elvégezzük a vizsgálatokat. A kapott eredményeket az 5. táblázat tartalmazza. A VIII. faktornak megfelelő aktivitás a közegből az oszlopba abszorbeálódik. Ezt az aktivitást azután eluálhatjuk az oszlopról, nagy sótartalmú oldat alkalmazásával (5. táblázat), amint az a humán VIII. faktornál várható. A BHK sejtek által termelt VIII. faktor tehát rendelkezik azzal a tulajdonsággal, hogy specifikus módon kölcsönhatásba lép von Willebrand faktornak megfelelő fehérjével. 5. táblázat Minta Abszorbancia 405 nm hullámhosszúságon1 Sejt tápközeg 0,143 Mosófolyadék 0,015 Élűéit frakciók: 1 0,000 2 0,410 3 0,093 4 0,017 5 0,000 6 0,000 1 A méréseknél a gyártó által javasolt módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy az összes térfogatértéket a felére csökkentjük. 10. .4 fúziós fehérjék analízise Ennek a kísérletsorozatnak az a célja, hogy bizonyítsa a klón által kódolt fehérje immunológiai azonosságát a plazmában lévő polipeptidekkel. Ehhez a gén egyes részleteit fúziós fehérjékként fejezzük ki Escherichia coli törzsben. A klónozott gén kódoló szekvenciáinak egésze vagy egy része kifejezhető olyan formában, amely antitestek létrehozásához alkalmas anyagot biztosit. Ezek az antitestek, amelyek specifikusak a klónozott fehérje kívánt tartományaira, alkalmazhatók a fehérjék analízisénél és tisztításánál. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 33
