202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
59 HU 202275 A faktor aktivitását. A 3. táblázatban található eredmények azt mutatják, hogy az oszlopról eluált VIII. faktor aktivitást (amely sokkal töményebb, mint a tápközeg), szintén semle-GO 1. táblázat Monoklonális antitesten tisztított VIII. faktor véralvasztó hatása gcsitik ezek a Vili. : faktor antitestek. 5 Minta Vérrögképződés 3. táblázat ideje, sec. Monoklonális antitest eluátum Rekombináns VIII. csúcsfrakcióinak kromogén vizsgálata 10 fák tor u 86,5 Rekombináns VIII. Minta Abszorbancia 405 nm faktor1* + hullámhosszúságon1 C7K7 antitest 101,3 Kontroll 101,3 Csúcsfrakció2 0,186 15 Rekombináns Vili. Csúcsfrakció + faktorlh 82,4 Vili. faktor Rekombináns Vili. antitest3 0,060 faktorlb + 10 lamb Puffer-oldat da szimiotikus (kontroll) 0,000 20 antitest 110,6 Puffer-oldat Kontroll2 95,5 (kontroll) + Vili. faktor 1 A VIII. faktor a C8 monoklonális gyantából antitest 0,045 eluált csúcsfrakció, amelyet az elúcióhoz 25 használt puffer eltávolítására 1,5 órán át (la) vagy 2 órán á t (lb) dializálunk. 1 A vizsgálatot a következőképpen vitelezzük 2 A kontrollként alkalmazott puffer-oldat ki: 50 ul mennyiségű hígított mintát 5 percig 0,05 M trisz-oldat (pH=7,3), amely 0,2% szarinkubálunk 50 jul térfogatú IXa faktor (X. faktor) foszfolipid oldattal 37 °C-on. Az elegyet 50 pl kalcium-klorid-oldattal inkubáljuk 10 percig 37 °C-on. Hozzáadunk 50 ul kromogén szubsztrátumot, majd 10 perc elteltével 100 ul 50%-os ecetsav hozzáadásával állítjuk le a reakciót. 2 A csúcsfrakciót a vizsgálatokhoz 1:100 arányban hígítjuk, 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó 0,05 M trisz-oldattai, pH pH=7,2. 3 Az antitest 10 pl szimbiotikus antitest, amelyet a hígított mintához adunk, és 5 percig inkubálunk szobahőmérsékleten. d. A tisztított VIII. faktor véralvasztó aktivitása A sejt tápközegében észlelt aktiv anyagot tisztítjuk és töményítjúk C8 monoklonális gyantán történő átengedéssel. A csúcsfrakciót az elúciós puffer eltávolítása céljából dializáljuk a következő összetételű oldattal szemben: 0,05 M imidazol, pH=6,9, 0,15 M nátrium-klorid 0,02 M glicin-etilészter, 0,01 M kalcium-klorid és 10% glicerin. Az aktiv csúcsfrakció véralvasztó hatását vizsgáljuk VIII. faktorban hiányos plazmában (4. táblázat). 84 másodperc elteltével figyelünk meg fibrinrógöt. A hemofíliás plazma önmagában 104,0 másodperc elteltével képez vérrögöt. Az eluált frakció tehát javítja a hemofíliás plazma csökkent mértékű véralvadását. Közönséges emberi plazmát hígítunk, és hasonló vizsgálatnak vetjük alá. Az ennek a plazmának a felhasználásával felállított standard görbe azt mutatja, hogy az eluált frakció VIII. faktor véralvasztó hatása közelítőleg 0,01 egvség/milliliter. 32 30 vasmarha szérum albumint tartalmaz. e. A tisztított Vili. faktor aktiválása trombinnal A VIII. faktor ismert tulajdonsága, hogy 35 a véralvasztó hatását a trombin aktiválja. A monoklonális oszlopról eluált frakciót analízisnek vetjük alá e tulajdonság vizsgálatára. Miután a mintát dializáltuk az elúcióhoz használt puffer eltávolítása érdekében, az 40 eluátum 100 «1 mennyiségét 100 ul 0,05 M imidazol-oldattal hígítjuk (pH=7,6), amely 0,15 M nátrium-kloridot, 0,02 M glicin-etil-észtert, 0,01 M kalcium-kloridot és 10% glicerint tartalmaz. 45 Ennek a hígításnak az a célja, hogy tovább hígítsuk az esetleg még jelenlevő elúciós puffert, amely zavarhatja a trombin aktiváló hatását. A hígítás további célja a reakcióelegy pH-értékének növelése. Az oldathoz 50 25 ng trombint adunk, és a reagáltatást szobahőmérsékleten folytatjuk. 25 ul térfogatú ülik vöt részeket veszünk ki a reakcióelegyből különböző időpontokban, 1:3 arányban hígítjuk, és meghatározzuk a véralvasztó ak- 55 tivitást. A kapott, eredményeket a 17. ábrán mutatjuk be. A VIII. faktor aktivitása növekszik az idő függvényében, majd csökken, amint az várható a VIII. faktor aktivitásnál. A hozzáadott trombinmennyiség hatására nem 60 képződik vérrög a VIII. faktorban hiányos vérplazmában a vizsgálatok során alkalmazott megfigyelési idők alatt. A véralvadási idő megfigyelt, a vizsgálati időtől függő növekedése, majd azt követő csökkenése bizonyítja, 65 hogy az aktivitás valóban annak következmé-
