202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
57 HU 202275 A 1. táblázat 58 pAML3P.8cl plazmiddal átfertózött BHK sejtvonal VIII. faktor tartalma a radioaktív immunvizsgálat alapján CIO C7F7 Sejt felülúszó 1. számú kísérlet 0,14 egység/ml 0,077 egység/ml 2. számú kísérlet 0,022 egység/ml 0,021 egység/ml Sejt lizátum 1. számú kísérlet 0,42 egység/ml 0,016 egység/ml A megkötött I125 izotóptól származó percenkénti beütés (cpm) értékeket a közönséges vérplazma higitásain alapuló standard görbe segítségével alakítjuk át egység/ml értékké. Valamennyi kapott érték lényegesen meghaladja a háttér értéket. A kimutatási 20 határ 0.005 egység/ml a CIO-nél, és 0,01 egység/ml a C7F7 vizsgálatánál. b. Kromogén vizsgálat BHK sejtet tartalmazó tápkőzegeken 25 Amint az a 2. táblázatból látható, az ezekből a sejtekből kialakult tápközegek abszorbanciát mutatnak 405 nm-nél a Coates vizsgálat szerint. Amint fentebb arra kitér- 30 tünk, ez a vizsgálat specifikus a VIII. faktor aktivitásra a X. faktor aktivitásánál. Amikor a VIII. faktorra specifikus monoklonális antitesteket adunk hozzá, csökkent a képződő Xa faktor mennyisége. Ez abból látható, hogy a tápközeg 0,155 értékű ab szór bandája 0,03 értékre csökkent antitesteket is tartalmazó tápközeg esetén (a vakpróbára kapott érték kivonása után). A sejtek tehát olyan aktivitást termelnek, amely jelentkezik egy, a VIII. faktor aktivitására specifikus vizsgálatnál, és ezt az aktivitást semlegesítik a VIII. faktorra specifikus antitestek. Amikor a tápközeget IXa faktor, X. faktor és foszfolipid hozzáadása nélkül reakcióelegyben inkubáljuk, a 405 nm hullámhosszúságon mért abszorbancia nem növekszik a vakpróbának megfelelő értékhez képest. A megfigyelt aktivitás tehát nem egy olyan nem-specifikus proteáz jelenlétének a következménye, amely elhasitja a szubsztrátumot, és az aktivitást emellett semlegesítik a VIII. faktorra specifikus antitestek. 2. táblázat BHK sejtvonal VIII. faktor aktivitása, kromogén vizsgálattal meghatározva1 Minta Abszorbancia 405 nm-nél Abszorbancia 405 nm-nél (a kontroll érték levonása után) Tápközeg 0,193 0,155 Puffer kontroll1 2 0,038 (0,0) Tápközeg + VIII. faktor antitest3 Puffer kontroll2 + VIII. 0,064 0,030 faktor antitest 0,034 (0,0) 1 A reakciókat a következőképpen módosítjuk: a IXa faktor (X. faktor) foszfolipid, a kalcium-klorid-oldat és az 1-100 higitású minta 50-50 /ul mennyiségét 10 percig inku- 55 báljuk 37 °C-on. 50 ul S2222-t adunk hozzá, 60 percig tartjuk 37 °C-on, és a reakciót 100 ul 50X-os ecetsav hozzáadásával állítjuk le. 2 A minta helyett használt pufferoldat 0,2% 50 szarvasmarha szérum albumint tartalmazó 0,05 M trisz-hidroklorid-oldat, pH=7,3. 3 Az antitest 10 /ug C8 és 10 pg C7F7 keveréke. A tápközeget 5 percig előinkubáljuk a vizsgálat megkezdése előtt. 65 c. Tápközegek kromatográfiája monoklonális gyantán VIII. faktor aktivitással rendelkező tápközegeket tartalmazó szérumot C8 monoklonális antitestet tartalmazó oszlopon kromatografálunk a fentebb leirt módon (a C8 monoklonális antitest 1984. árpilis 20-án lett deponálva ATCC 40115 számon). Az eluált frakciókat 1:100 arányban hígítjuk, és meghatározzuk az aktivitást. A hígított csúcs-frakció 50 ul térfogatú mennyiségeihez különféle monoklonális antitesteket adunk, amelyekről ismeretes, hogy semlegesítik a plazma VIII. 31
