202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
55 56 HU 202275 A A VIII. faktor teljes cDNS tartományát háromrészes ligálással alakítjuk ki. A pCVSVE/10.3 plazmidot felnyitjuk Clal és EcoRI enzimekkel, majd vektorként használjuk a pF8Cla-Sca-ból származó, 3870 bázispáros Clal/Scal töredék és a pF8Sca-RI-ból származó 3182 bázispáros Scal/EcoRI töredék beillesztéséhez. Az így nyert kifejező plazmid elnevezése pSVEFVIlI. b. Konstrukció a VIII. faktor kifejezésére szövettenyészet sejtjeiben. Egy másmilyen vektor, amely a PSVEFVIII plazmidon alapul, és tartalmazza az ade- 15 novírus tő késői promotorát, a háromrészes vezető szekvenciát és egy rövidített VIII. faktor leforditatlan 3’ tartományt, BHK sejtekbe történő stabil átfertózés után aktív VIII. faktort termel. A 12. ábra az aktív VIII. faktort termelő kifejező plazmid, a pAML3P.8cl kialakítását mutatja be. Ehhez először Klenow DNS I polimerázzal eltávolitjuk az SstlI helyet a pFDll-ból [1983. január 19-én benyújtott, 25 459 152 sz. amerikai _ egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés] és a Clal helyet a pEHED22-ból [Simonson és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, 2495 (1983)]. Ezek a helyek a DHFR gén 3’ illetve 5’ leforditatlan 30 tartományaiban találhatók ezeken a plazmidokon. Ezután háromrészes ligálást végzünk a törölt helyeket tartalmazó töredékekkel és a fenti pCVSVEHBS plazmidból származó hepatitisz B felületi antigén génnel. Ilyen módon a 35 pCVSVEHED22aCS vektort kapjuk, amely C6ak egyetlen Clal helyet és egyetlen SstI helyet tartalmaz. Az összeállított VIII. faktor gént tartalmazó pSVEFVIlI plazmidot (11. ábra) elhasítjuk Clal és Hpal enzimmel. Ezáltal kimetsszük a teljes kódoló tartományt és a 3’ leforditatlan tartománynak mintegy 380 bázispár nagyságú részét. Ezt beillesztjük a Clal, SstlI deléciós vektorba az egyedüli Clal és Hpal helyekre, helyettesítve a felületi an- 45 tigén gént. így a pSVE.8clD termelő plazmidot kapjuk. Az adenovirus fő késői promotorát háromrészes 5’ vezetőjével együtt állítjuk öszsze az adenovirus genom részeinek két al- 50 klónjából, a pEHD22 DHFR-termeló plazmiddal együtt [459 152 sz. . amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés]. A két adenovirus alklón - pUCHSX és pMLP2 - kialakulását a módszereknél ismertettük. A pMLP2 55 tartalmazza az S6tl-től HindIII-ig terjedő töredéket adenovirusból, amelynek koordinátái 15,4-17,1, a pUC13 SstI és Hindin közötti helyére klónozva [Viera és munkatársai, Gene 19, 259 (1982)). A pUCHSX a Hindill és Xhol közötti töredéket tartalmazza (koordinátái: 17,1-26,5), amely a pUC13 Hindin és Sáli közötti helyére van klónozva. A hindii! helyen összeállítva, ez a két adenovirus töredék tartalmazza az adenovirus fő késői promotorát, az első két exon és intron egészét, to- 30 vábbá a harmadik exon egy részét az 5' leforditatlan tartományban lévő Xhol helyig. Háromrészes ligálással állítjuk össze a DHFR gén előtti adenovirus promotort a 5 pAML3P.D22 plazmidban. Ezzel egy Clal helyet alakítunk ki röviddel a korábbi Xhol hely után az adenovirus háromrészes 5' vezető harmadik exonjában. Végül a VIII. faktort kifejező pSVE.8clD plazmid SV40 korai 10 promotorát eltávolítjuk Clal és Sáli enzimekkel, és egy SV40 korai adenovirus tandem proraotorral helyettesitjük (lásd a 12. ábrát), így a végső pAML3P.8cl kifejező plazmidot kapjuk. Ez a plazmid tartalmazza az adenovirus háromrészes vezetőt, amely a harmadik exonban lett a VIII. faktor 5’ leforditatlan tartományához kapcsolva. Utána a VIII. faktor teljes hosszúságú szerkezeti génje következő zik, jelszekvenciájával együtt. A VIII. faktor gén 3' leforditatlan tartománya a Hpal helyen kapcsolódik a hepatitisz B felületi antigén gén 3' leforditatlan részéhez. Ezt a DHFR gén követi, amely rendelkezik egy SV40 korai promotorral és egy hepatitisz 3’ leforditatlan tartománnyal, amely funkcionális poliadenilezési jelet biztosit. A VIII. faktort kifejező pAML3P.8cl plazmidot BHK sejtekbe fertőzzük át a neomicinnel szemben rezisztens pSVEneBal6 vektorral (1984. április 20-án lett ATCC CRL 8544 számon deponálva) együtt. Ezeket a sejteket először G418 segítségével, majd utána metotrexáttal szelektáljuk. A BHK sejtvonal által termelt VIII. faktor RNS-t először úgy azonosítjuk, hogy elvégezzük a poli (A)* citoplazmás RNS Northern-féle analízisét 32P izotóppal jelzett VIII. faktor DNS vizsgálómintához történő 40 hibridizálással. Ennél az analízisnél 9 kb körüli hosszúságú sávot kapunk. A hibridizálási intenzitások alapján ez a sáv 100-200-szorosra dúsul, a CH-2 sejtvonalban található 9 kb nagyságú sávhoz képest. 9. A rekombináns VIII. faktor azonosítása a. Radioaktiv immunvizsgálat Radioaktív immunvizsgálatot végzünk a módszerek ismertetésénél leírtak szerint a VIII. faktort termelő BHK sejtvonalból nyert felülúszó folyadékokon és lizált sejteken. Az eredményeket tartalmazó 1. táblázat azt mutatja, hogy a felülúszó folyadékok (amelyek a VIII. faktor aktivitását tartalmazzák) közelítőleg azonos mennyiségben magukban foglalják a VIII. faktor 210 kD molekulatömegű ré- 60 szét (CIO) és 80 kD molekulatömegű részét (C7F7) is. A VIII. faktor a sejtlizátumokban is kimutatható. A VIII. faktort ki nem fejező, kontrollként alkalmazott sejtvonalaknál a radioaktív immunvizsgálat során kapott érték 65 kisebb, mint 0,001 egység/ml.
