202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
53 HU 202275 A 54 tatlan tartományában helyezkedik el, a SacI hely pedig a 10. helyzetű nukleotidnál lévő ATG iniciációs kodonon túl 10 bázispárral található [10. ábra]. Az összes restrikciós hely nukleotid helyzetét a 10. ábrán bemutatott módon számozzuk, az ATG iniciációs kodon A nukleotidjával kezdve). A pF8Cla-Sac-ból egy 85 bp-s Clal/SacI töredéket különítünk el, amely 11 bázispárt tartalmaz az adapter szekvenciából (az 5’ ATCGATAAGCT adapterszekvencia teljesen a pBR322 plazmidból származik), és egy, a lambda 13.2-ből származó 1801 bázispáros SacI/KpnI (1811. nukleotid) töredékkel együtt ligáljuk egy Clal/KpnI vektorhoz, amely a VIII. faktor HindlII töredékét (1019- -2277. nukleotid) tartalmazó pBR322 alklónból készült. Ez a pF8Cla-Kpn elnevezésű közbenső termék tartalmazza a VIII. faktor kezdeti 2277 kódoló nukleotidját, előtte 65 5’ lefordíthatatlan bázispárral és a 11 bázispáros Clal adapter szekvenciával. A pF8Cla-Kpn közbenső terméket a pBR322 részben KpnI és Sphl enzimmel felnyitjuk, és a kapott terméket vektor-töredékként használjuk egy 466 bázispárból álló KpnI/HindlII töredékkel és egy 1654 bázispárból álló HindlII/Sphl (4003. nukleotid) töredékkel történő ligálásban. (A KpnI/HindlII töredék a lambda 13.2 EcoRI alklónjából, a HindlII/Sphl töredék pedig a B-exont tartalmazó p222.8 alklónból származik), így a pF8Cla-Sph terméket kapjuk, amely a VIII, faktor kódoló szekvenciájának első 3931 bázispárját tartalmazza. A kódoló tartomány középső részét három pBR322/cDNS klón vagy alklón töredékeinek háromrészes ligálásával nyerjük. A p3.48 kiónt felnyitjuk BamHI (4743. nukleotid) és Sáli alkalmazásával) a pBR322-tet tartományban), hogy vektorként szolgáljon. Ezekbe a helyekbe ligálunk egy 778 bázispáros töredéket (BamHI/Ndel töredék, 5520. nukleotid), amely a p3.12-ból származik, és egy 2106 bázispáros Ndel/Sall töredéket (pBR322-ben), amely a p-lambda-10.44R1.9 alklónból származik. A megfelelő összekapcsolás a pF8Sca-RI plazmidot eredményezi, amely tetraciklinnel szemben rezisztens. A VIII. faktor cDNS 3’ végének legtöbb részét közvetlenül egy SV40 kifejező vektorba klónozzuk. A pCVSVEHBV plazmid tartalmaz egy SV40 korai promotort, amelyet egy polilinker és a hepatitisz B felületi antigén gén követ. A pCVSVEHBV plazmid, amelyet pCVSVEHBS jelöléssel is illetnek, a p342E kis mértékű variánsa [Crowley és munkatársai, Moll. Cell. Bioi., 3, 44 (1983)]. Ezt a plazmidot a következőképpen állitjuk elő: Az 540 bázispárból álló HindlII-HindlII töredéket, amely átfogja az SV40 replikációs origót [Liu és munkatársai, DNA, 1, 213 (1982)], a pML plazmidhoz ligáljuk [Lusky és munkatársai, Nature, 293, 79 (1981)], az EcoRI hely és a HindlII hely közé. A plazmid EcoRI helyét és az SV40 HindlII helyét tompavégüvé tesszük oly módon, hogy Klenow DNS polimeráz I-t adunk hozzá a 4 dNTP jelenlétében, a HindlII enzimmel végzett emésztés előtt. A kapott pESV plazmidot emésztjük HindlII és BamHI enzimmel, és elkülönítjük a 2900 bázispáros vektortöredéket. Ehhez a töredékhez ligálunk egy 2025 bázispáros HindlII-BglII töredéket, amely a HBV-ből származik, és amelyet úgy módosítunk, hogy az EcoRI helyen egy polilinkert (több restrikciós helyet magábafoglaló DNS töredéket) tartalmazzon. A HBV töredék átfogja a felületi antigén gént, és a klónozott HBV DNS EcoRI és BglII enzimmel végzett emésztéséből származik [Liu és munkatársai, DNA, 1, 213 (1982)]. A kettősszálú kapcsoló DNS töredéket: (5’ dAAGCTTATCGATTCTAGAATTC 3’...) emésztjük HindlII és EcoRI enzimmel, majd a HBV töredékhez adjuk, HindlII-BglII töredékké alakítva át az EcoRI-BglII töredéket. Ez elvégezhető ugyan háromrészes ligálással - a kapcsoló, a HBV töredék és a vektor ligálásával, - mégis célszerűbb ha először a HindllI-EcoRl kapcsolót hozzáadjuk a klónozott HBV DNS-hez, majd pedig kihasítjuk a HindlII-BglII töredéket a plazmid fenti enzimekkel végzett együttes emésztésével. Ezért ez utóbbi módszer szerint járunk el. A képződő pCVSVEHBV plazmid tartalmaz egy bakteriális replikációs origót a pBR322- ből származó pML-ből, tartalmazza az amplicinnel szembeni rezisztencia jelzőjét, szintén a pML-ből, tartalmaz egy olyan orientációjú SV40 töredéket, hogy a korai promotor irányítsa a beillesztett HBV töredék átírását, valamint tartalmazza a HBV-től származó felületi antigén gént. A HBV töredék poliadenilezési jelet is biztosit a poliadenilezett mRNS-ek termeléséhez, amelyek általában az emlős sejtek citoplazmájában képződnek. A pCVSVEHBV plazmid tartalmaz egy hasznos Clal helyet, közvetlenül 5’ irányban a polilinkerben lévő Xbal helyhez képest. Ezt a plazmidot Xbal és BamHI enzimekkel felnyitjuk (a hepatitisz Ag 3* lefordítatlan tartományban), és a végeket betöltjük DNS polimerázzal. Ez eltávolítja . a hepatitisz felületi antigén kódoló tartományt, megmarad azonban a 3’ poliadenilezési jeltartománya, valamint az SV40 promoter. Ebbe a vektorba ligálunk egy, a lambda 10.3 cDNS klónból származó 1883 bázispáros EcoRI töredéket (amelynek a végei betöltötték). Ez tartalmazza a VIII. faktor végső 77 kódoló bázispárját, az 1805 bázispáros 3’ lefordítatlan tartományt, 8 adenozin maradékot, és a betöltött EcoRI adaptert. A betöltött restrikciós helyek összekapcsolásával ismét létrehozzuk az EcoRI véget az 5’ végződésnél (a betöltött Xbal helyet egyesítjük a betöltött EcoRI hellyel), megszüntetjük azonban a 3’ végződésnél) a betöltött EcoRI helyet egyesitjük a betöltött BamHI hellyel). Ez a plazmid a pCVSVE/10.3 elnevezést kapja. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 29
