202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
49 HU 202275 A 50 kapunk és vizsgálunk át hibridizálással, a korábbi pl. 11 cDNS klónból származó, 364 bázispárból álló Sau3A/StuI töredék segítségével. A vizsgálómintának használt töredéket szándékosan úgy választottuk ki, hogy ne fedje át a hibridkiválasztáshoz használt DNS-t. Ilyen módon elkerüljük olyan ál-rekombinánsok azonosítását, amelyek bizonyos Stul/HincII DNS töredéket tartalmaznak, és változatlanul szabadulnak fel a DBM cellulózról. 29 hibridizáló tenyészetet kapunk. Ez durván 250-szeres dúsítást jelent a kívánt klónokból a korábbi eljáráshoz képest. A 29 új rekombináns mindegyikét restrikciós feltérképezéssel jellemezzük, és a két leghosszabb termék (p3.12 és p3.48; 9. ábra) szekvenciáját meghatározzuk. Ezek a cDNS kiónok mintegy 1500 bázispér értékkel nyúlnak túl 5’ irányban, mint a pl. 11. A cDNS és genoinikus kiónok párhuzamos feltérképezése és szekvencia-analízise egy szokatlanul nagy exon (B. exon, 4. ábra) jelenlétét tárja fel, amely átfogja a p3.12-t és p3.48-at. E megfigyelés alapján kiterjesztjük a lambda 222 genomikus klón DNS szekvencia analízisét a fenti exon nagyságának meghatározására. A B. exontartomány tartalmaz egy nyitott leolvasókeretet, amelynek nagysága 3 kb körüli. A 2. és 3. számú 16-mer aktiválókat szintetizáljuk, hogy illesszük a szekvenciát ebben a nagy exonban, abban a reményben, hogy jelentős mértékben kiterjesztjük a cDNS klónozást. Ezen a ponton kimutatjuk, hogy egy bakteriofág-alapú cDNS klónozó rendszer alkalmazható, lehetővé téve óriási számú cDNS klón termelését és szűrővizsgálatát, hibrid-kiválasztással történő előzetes dúsítás nélkül. A lambda GT10 [Huynh és munkatársai, Practical Approaches in Biochemistry, IRL Press Ltd., Oxford, England, 1984] lambda fág származék, amelynek a represszor génjében egyetlen EcoRI restrikciós hely található. Ha kétszálú cDNS töredékeket EcoRI helyek szegélyeznek, ezek ligálhatók ebbe az egyetlen helybe. Ha idegen DNS-t illesztünk be ebbe a helybe, a fég represszor negatívvá válik, és tiszta tarfolt képződik. A betét nélküli lambda GT10 zavaros tarfoltokat képez, amelyek így megkülönböztethetők a rekombinánsoktól. A fág .csomagolás‘-ban levő nagy transzformélási hatékonyságon túlmenően a lambda cDNS tarfoltok könnyebben vizsgálhatók ét nagyobb sűrűségnél, mint a baktérium-telepek. Kétszálú cDNS-t készítünk a korábban leírtak szerint, a 3. számú primer felhasználásával. Ez a primer 5’-AACTCTGTTGCTGCAG, amely körülbelül 550 bázispárral helyezkedik el a B. exon feltételezett 5’ végétől lefelé. EcoRI .adaptereket" ligálunk a .tompa’ végű cDNS-hez. Az adapterek egy kiegészítő szintetikus 18-merböl és 22-merböl állnak, amelyek szekvenciája 5’-CCTTGACCGTAAGACATG illetve 5’-AATTCATGTCTTACGGTCAAGG. A 18--mer 5’ végét foszforilezzük, mig a 22-mer 5’ végén megtartjuk az 5’-OH csoportot, amellyel azt szintetizáltuk. Így, amikor összeforrasztjuk és ligáljuk a cDNS-sel, az adapterek túlnyomó EcoRI helyeket képeznek, amelyek önligálódásra nem képesek. Ez lehetőséget ad arra, hogy elkerüljük a cDNS EcoRI metilezését, és utána az EcoRI-emésztést, amig más ismert eljárásoknál a kapcsolóval történő ligálás után bekövetkezik [Maniatis és munkatársai, Cell, 15, 687 (1963)]. Miután a gélen méretkiválasztás céljából elkülönítettük a cDNS-t és eltávolítottuk a reagálatlan adaptereket, e cDNS ekvimoláris mennyiségét ligáljuk EcoRI enzimmel hasított lambda GTlO-hez, .csomagoljuk,' és Escherichia coli c600hfl-t tartalmazó lemezre szélesztjük. 1 ug poli (A)* RNS-ből körülbelül 3 millió kiónt szélesztünk ét 50 darab 150 mm átmérőjű Petri-csészébe, és hibridizációs átvizsgálást végzünk a B. exon 5’ végéből származó, 300 bázispór nagyságú HinfI töredékkel. 46 párhuzamosan is pozitív eredményt adó mintát azonosítunk és elemzünk EcoRI emésztéssel. Úgy tűnik, hogy a számos cDNS betét körülbelül 2500 bázispárral túlnyúlik a 3. számú primertől 5’ felé. Ezeket a hosszú kiónokat a DNS szekvencia meghatározásával vizsgáljuk. A lambda 13.2 és a lambda 13.27 5’ végeinek szekvenciája a 10. ábrán látható. Ezek számos olyan vonással bírnak, amely arra mutat, hogy elértük a Vili. faktort kódoló tartomány 5’ végét. A kiindulási 109 bézispár megállító (stop) kodonokat tartalmaz az összes lehetséges leolvasó keretben. Ezután megjelenik egy ATG triplett, s azt egy nyitott leolvasó keret követi a lambda 13.2-ben lévő, 2724 bázispárból álló cDNS betét fennmaradó része számára. Az ATG iniciátort követő szekvencia lefordítása egy 19 aminosavból álló szekvenciát szolgáltat, amely jellemző egy kiválasztott fehérje .vezető" vagy .elő‘-szekvenciára [Perlman és munkatársai, J. Mól. Bioi., 167, 391 (1983)]. Feltűnő jellemzője az, hogy két, töltéssel rendelkező gyök határol egy 10 aminosavakból álló hidrofób magot. E feltételezett vezető szekvencia után egy olyan tartomány helyezkedik el, amely a VIII. faktor trombinos feltárásánál képződő, 210 kD és 95 kD molekulatömegű termékek fehérjeszekvencia-analiziséból nyert amino-terminális maradékoknak felel meg. c. 01igo(dT)-vc] beindított cDNS klánok A VIII. faktor mRNS több ezer további 3' bázisa marad vissza, hogy cDNS-sé alakítsuk. Választásunk szerint fordított átírást indítunk be oligo(dT) segítségével, és olyan cDNS kiónokat keresünk, amelyek az mRNS 3' poli(A)* farkait tartalmazzák. A kiónok dúsításánál és a DNS második szála szintézis hatékonysága növelésénél az ismert és megalapozott eljárásokat a cDNS második szál 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 27
