202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
47 HU 202275 A 18 azonban, hogy a sejttípus vagy a fajták változékonysága okozza ezt az eltérést. 7. cDNS klónozása a. Egy VIII. faktor mRNS-t termelő sejtvonal azonosítása Annak érdekében, hogy azonosítsunk egy RNS-forrást a VIII. faktor cDNS kiónok 10 elkülönítéséhez, poliadenilezett RNS-t különítünk el számos emberi sejtvonalból és szövetből, és szűrővizsgálatot végzünk Northern-féle folthibridizációval, a lambda 120 A. exon-tartományából nyert, 189 bázispárból 15 álló StuI-HinclII töredék alkalmazásával. A CH-2 humán T-sejt hibridomából nyert poly(A)‘ RNS hibridizáló RNS-nek mutatkozik. A hibridizáló RNS mérete becslésünk szerint 10 kb körül van. Ez olyan méretű mRNS, 20 amelytől várható, hogy egy 300 kD körüli molekulatömegű fehérjét kódoljon. Kontroll DNS pont folt (.dot-blof) hibridizációkkal [Kafatos és munkatársai, Nucleic Acids Res., 7, 1541 (1979)] végzett összehasonlítás alap- 25 ján ez az RNS-mennyiség 0,0001-0,001X-a a CH-2 sejtvonalban lévő teljes sejt poli(A)* RNS mennyiségnek. Ez az eredmény arra mutat, hogy a VIII. faktor cDNS szekvenciáknak ebből a forrásból történő elkülönítése spéci- 30 fikus szekvenciák további dúsítását igényli, máskülönben rendkívül nagy számú cDNS klón szűrővizsgálatát kell elvégeznünk. b. Fajlagosan beindított cDNS kiónok 35 A VIII. faktor genomikus kiónok DNS szekvencia-analizise lehetővé teszi 16 bázisos szintetikus oligonukleotidok szintézisét a cDNS első szálénak szintézisénél a fajlagos 40 beindításhoz. Általában oligo(dT)-t használunk a cDNS szintézisének beindításához az mRNS poli(A) farkainál. A fajlagos beindításnak két előnye van az oligo(dT) alkalmazásához képest. Először, dúsítja a VIII. faktor 45 cDNS klón populációt. Másodszor, a gén olyan tartományaiban helyezi el a cDNS kiónokat, amelyekre vonatkozólag hibridizáló vizsgálómintákkal rendelkezünk. Ez különösen fontos egy ilyen nagy gén klónozásakor. Tekintettel 50 arra, hogy a cDNS kiónok ritkán hosszabbak 1000-2000 bázispérnél, az oligo(dT) segítségével beindított kiónok rendszerint nem mutathatók ki olyan vizsgálómintával, amely a Vili. faktor génjének legtöbb tartományából 55 készült. Alkalmazott módszerünk abból áll, hogy a kiindulási A. exon tartományból származó DNS töredékeket és szekvenciainforraációt használjuk fel a fajlagosan beindított cDNS kiónok előállításához. Úgy járunk el, gy hogy egy sor átfedő cDNS kiónt állítunk elő az 5’ irányban a korábban kialakított cDNS kiónok jellemzése alapján. Annak érdekében, hogy a cDNS még inkább a 3’ tartományban legyen 3’ exonokból származó cDNS és genom gg klón töredékeket alkalmazunk az oligo(dT) segítségével aktivált cDNS kiónok kimutatásához. A cDNS klónozó eljárások számos típusét. felhasználjuk kísérleteink folyamán; 5 ezekkel a későbbiekben foglalkozunk. A kiindulási fajlagos cDNS prímért: ö’-CAGGTCAACATCACAG (1. számú primer, lásd a 9. ábrát) az A. exon szekvencia 16 3’-terminális maradéka reverz kiegészítéseként szintetizáljuk. C-farokkal ellátott cDNS-t 5 Mg mennyiségű CH-2 sejt poli(A)‘-RNS-böl szintetizálunk 1. számú primer alkamazásával, és G-farokkal ellátott pBR322-hez forrasztjuk Capon és munkatársai általános módszerével [Nature, 301, 507 (1983)]. Mintegy 100.000 Escherichia coli transzformánst szélesztünk át 100 db 150 mm méretű lemezre, és szűrővizsgálatot végzünk [Maniatis és munkatársai fentebb idézett munkája] a lambda 120 genomikus klón A. exon tartományából származó, 189 bázispárból álló StuI/HinclI töredékkel hibridizálva. (4. ábra). Egy szigorúan hibridizáló kiónt (.pl. 11") kapunk (lásd a 9. ábrát). A pl. 11 klón DNS szekvencia analízise azonosságot mutat a VIII. faktor genomikus klónjaikkal. A pl.11 klóriban lévő 447 bázispár nagyságú cDNS betét tartalmazza a genomikus A. exon első 104 bázispárját (a második szál szintézise nyilvánvalóan nem nyúlt vissza a primerekhez), majd folytatódik tovább egy olyan résszel, amelyről később kimutatjuk, hogy az a B. és C. exon. Az A. exontól való elválás 5’ pontját egy jellegzetes RNS összekapcsoló akceptor hely határolja [Sharp, Cell, 23, 643 (1981)]. Jóllehet eddig bemutattuk, hogy a VIII. faktor cDNS kiónok előállithatók a CH-2 sejtvonalból, további finomításokat végzünk az eljáráson. Különféle erőfeszítéseket tettünk, hogy tovább dúsítsuk a CH-2 RNS-t a VIII. faktor .üzenet'-hez. Egy eredményes módszer szerint a fajlagosan beindított egyszálú cDNS szintézist kombináljuk a kapott egyszálú cDNS hibrid kiválasztásával. Az egyszálú cDNS szintézishez az 1. számú prímért használjuk 200 /jg poli(A)' CH-2 RNS-sel együtt. Ahelyett, hogy DNS polimerázt használnánk ennek kétszálú DNS-sé történő azonnali átalakításához, az egyszálú DNS-t 2 Mg mennyiségű, 189 bázispárból álló, StuI/HincII genomikus DNS töredékhez hibridizáljuk, ahol ez utóbbit előzetesen hozzákapcsoltuk aktivált ABM cellulózpapírhoz (Schleicher és Schuell .Transa-Bind", lásd Maniatis idézett munkáját). Mig általában az RNS-t vetik alá hibrid-kiválusztásnak, mi az eljárást a cDNS szintézis után alkalmazzuk, hogy elkerüljük a ritka, nagy és viszonylag bomlékony VIII. faktor RNS molekulák további kezelését. Elúció után az anyagot kétszálú cDNS-sé alakítjuk, méret szerint osztályozzuk, és a kinyert DNS 0,5 ng mennyiségét C-farokkal látjuk el és pBR322-be klónozzuk a korábban leírtak szerint. Mintegy 12.000 rekombináns kiónt 26
