202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
45 Hl! 202275 A 46 keket illesztünk egy SV40 promotort tartalmazó plazmidba, és jelentős mennyiségű rekombináns RNS-t termelünk, amelyet átfertőzött majom cos sejtekben dolgozunk fel. A képződő összeillesztett RNS közvetlenül analizálható, vagy felhasználható anyagot nyújt cDNS klónozáshoz. Legalábbis elméletileg ez a módszer használható lehet a Vili. faktor gén teljes összeillesztett változatának az összeállításához. Az első exon-kifejező konstrukcióinknál meglévő SV40 cDNS vektorokat használtunk, amelyek a hepatitisz felületi antigén génjét fejezik ki [Crowley és munkatársai, Mol. Cell. Bioi., 3, 44 (1983)]. Az ezekbe a vektorokba klónozott genomikus VIII. faktor töredékek azonban nem szolgáltatnak megfigyelhető mennyiségű VIII. faktor RNS-t, amikor analízist végzünk folt hibridizációval. Úgy véljük, hogy a nehézséget az okozhatja, hogy ezeknek az összeállításoknak a folyamán a cDNS vektorok exon-tartományait hozzákapcsoltuk a VIII. faktor génjének intron részeihez. Ennek elkerülésére, a pESVDA exonkifejező vektort hozzuk létre a 6. ábrán látható módon. Ez a vektor tartalmazza az SV40 korai promotort, az adenovirus II fő késői első összekapcsoló donorhelyét, intron szekvenciákat, amelyekbe klónozhatok a genomikus VIII. faktor töredékek, utána az adenovirus II Elb összekapcsoló akceptorhelyét, valamint a hepatitisz B felületi antigén 3’ lefordíthatatlan- és poliadenilezési szekvenciáit [Gingeras és munkatársai, J. Bioi. Chem., 257, 13475 (1982)]. Legelőször a lambda 114 9.4 kb nagyságú BamHI töredékét és 12,7 kb nagyságú SstI töredékét klónozzuk a pESVDA intron tartományába, (lásd 6. ábrát). Az ezzel a két szerkezettel szintetizált RNS Northern-féle folt analizise cos sejtek átfertózése után a 7. ábrán látható. A 9,4 kb nagyságú BamHI szerkezet alkalmazásakor körülbelül 1,8 kb nagyságú hibridizáló RNS sávot találunk az A exonra és a hepatitisz 3’ leforditatlan szekvenciára vonatkozó vizsgálóminták segitségével. Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk az RNS-t az új VIII. faktor exonokra vonatkozólag, egy párhuzamos mezőben a lambda 114 2,0 kbp nagyságú StuI/BamHl töredékét (A exon 3’ vége) hibridizáljuk. Ennél a vizsgálómintánál szintén egy 1,8 kb nagyságú RNS sáv mutatkozik, ami arra mutat, hogy további új VIII. faktor exonok vannak jelen ebben a tartományban. E három vizsgálóminta mindegyike szintén hibridizál egy olyan RNS sávhoz, amely egy 12,7 kb nagyságú SstI genomikus töredéket tartalmazó konstrukcióból származik. Ez az RNS sáv mintegy 2,1 kb nagyságú. Ez a megfigyelés arra mutat, hogy az exon szekvenciáknak egy további, 200-300 bázispárból álló részét tartalmazza ez a szerkezet, a 9,4 kb nagyságú BamHI töredéket határoló BamHI helytől 3’ felé. Az összehasonlító kísérletek azt mutatják, hogy ez a rendszer képes az ismert exontartományok helyes összekapcsoláséra. Rágcsáló dhfr 3,2 kb nagyságú genomikus HindllI töredékét - amely átfogja a III. és IV. exont - klónozzuk pESVDA-ba. Egy 1 kb nagyságú RNS sávot találunk a rágcsáló dhfr vizsgáló mintával. Ez a várható méret, ha az exonokat helyesen kapcsoljuk össze. A VIII. faktor 9,4 kb nagyságú BamHI genomikus töredékével vagy a 3,2 kb nagyságú dhfr genomikus töredékkel létrehozott, ellenkező irányitottságú szerkezetek egyik vizsgálómintával sem adnak megfigyelhető RNS sávot. (7. ábra). A 12,7 kb nagyságú SstI szerkezetből nyert RNS cDNS másolatát pBR322 plazmidba klónozzuk, és szűrővizsgálatot végzünk. Egy közel teljes hosszúságú (1700 bázispár) cDNS kiónt (S36) találunk. A 8. ábrán mutatjuk be a 950 bázispárból álló SstI töredék szekvenciáját; ez a töredék az egész VIII. faktor betétet és a pESVDA vektor egy részét tartalmazza valamelyik oldalon. A szekvencia a várt módon, az adenovirus összekapcsoló donor és akceptor szekvenciákkal kezdődik és fejeződik be. Közöttük helyezkedik el a VIII. faktor 888 bázispárból álló szekvenciája, amely az A. exont is tartalmazza. Az A. exont megelőző 154 bázispár és az azt követő 568 bázispár a Vili. faktor több 80K triptikus töredékét tartalmazza, bizonyítva, hogy ezek újonnan azonosított exonok. Az ezeknek az exonoknak megfelelő genomikus tartomány szekvenciái azt mutatják, hogy az A. exontól 5’ felé lévő 154 bázispár a C. exonban található meg, és az A. exonból 3* felé levő tartomány pedig 3 exonból, a D., E. és exonból áll, amelyek 229, 193 illetve 156 bázispárt tartalmaznak. A felsorolt exonok mindegyike megfelelő összekapcsolódó donor és akceptor hely segítségével kötődik [Breathnach és munkatársai, Ann. Rev. Biochem., 50, 349 (1981); Sharp, Cell, 23, 643 (1981)]. Amikor az S36 exon-kifejező cDNS-t összehasonlítjuk a VIII. faktor sejtvonal cDNS kiónokkal, azt tapasztaljuk, hogy az S36 valamennyi összekapcsolt VIII. faktor szekvenciája a VIII. faktor exonjaiból származik. Ide tartoznak a várt módon a C., A., D., E. és I. exonok. Az A. exonból azonban 47 bázispár hiányzik a C. és A. exon összekapcsolódásánál, az F., G. és H. exon pedig teljesen kimarad. Az ilyenfajta eltérő RNS felhasználásból eredő leolvasókeret-eltolódások azt mutatják, hogy ezek nem felelhetnek meg pontosan a VIII. faktor szekvenciájának. A C. és A. exon összekapcsolódásánál az autentikus összekapcsolódási hely helyett egy konszenzus összekapcsolódási helyet használunk. Az S36 klón eltérő kapcsolódása, összehasonlítva az autentikus VIII. faktor átirattal, annak lehet a következménye, hogy az RNS elsődleges átírásának csak egy része fejeződik ki a cos sejt szerkezetben. Az is lehetséges 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 25
