202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
43 Ilii 302375 A 44 3. A pGcos4 vektorban található egy mutáns dihidrofolét reduktáz gén, amely magéba foglal egy SV40 replikációs origót és promotort. Ezáltal bármelyik, ebbe a vektorba klónozott töredék sokféle eukarióta sejtben válik szaporíthatóvá. Várakozásaink szerint ez hasznos lehet a természetes promotoraikkal biró nagy genomikus DNS töredékek kifejezésében. 4. A klónozó hely kialakításához EcoRI, Pvul, BumHl, Pvul és EcoRI restrikciós helyeket tartalmazó szintetikus 20-mert klónozunk a pBR322-ból származó EcoRI helyre. Az egyedi BamHI helyet a genomikus DNS 35-45 b nagyságú Sau3Al töredékeinek klónozására használjuk fel. A szegélyező EcoRI helyek a betét EcoRI töredékeinek alklónozésához használhatók fel. A legtöbb esetben a Pvul helyek az egész betét hasításához hasznosíthatók. A Pvul helyek rendkívül ritkák eukarióta DNS-ekben, és várhatóan minden 134.000 bázispárban csak egyszer fordulnak elő az emberi DNS dinukleotid-gyakoriságai alapján. Az 5. ábrán bemutatjuk a pGcos4 kozmidvektor felépítésének vázlatát. A 49.XXXXY DNS 35-45 kb nagyságú Sau3Al töredékeit klónozzuk ebbe a vektorba. Mintegy 150.000 rekombinánssal végzünk 2-2 párhuzamos szűrővizsgálatot a lambda 222 2,4 kb nagyságú EcoRI/BamHI töredéke (5’-végén) é6 a lambda 482 1 kb nagyságú EcoRI/BamHI töredéke (3'-végén) segítségével. Ezek egyetlen példányban lévő vizsgálóminták, amelyek a meglévő genomikus tartomány végei közelében azonosíthatók. Négy pozitív eredményt adó kozmid kiónt különítünk el és térképezünk fel. A 4. ábrán szerepel a p541, p542 és p543 kozmid. A szűrővizsgálatból megállapítjuk, hogy ezek a kozmid kiónok összesen 114 kilobázispár értékre növelik a VIII. faktor genomikus tartományát. A cDNS kiónok kai ezt követően végzett vizsgálatok számos exont azonosítanak az átfedő genomikus kiónok meglévő készletéből, jelzik azonban, hogy a genomikus .séta" még nem teljes. További lépéseket végzünk mindegyik irányban. A p542 kozmid egyik 1,1 kb nagyságú BamHI/EcoRI töredékéből 3’ .séta" vizsgálómintát készítünk. (4. ábra). Ez a vizsgálóminta kimutatja a p613 átfedő kozmid kiónt, amely mintegy 35 kb értékkel nyúlik túl a 3’ végen. Később a teljes VIII. faktor üzenetszekvenciát megkapjuk cDNS klónozással (lásd alább). Amikor a cDNS 3’-terminális részét tartalmazó, 1,9 nagyságú EcoRI cDNS töredéket humán genomikus és kozmid klónozott DNS Southern - foltjaihoz hibridizáljuk, ez egy egyedi 4,9 kb-s EcoRI sávot és 5,7; 3,2 és 0,2 kb nagyságú BamHI sávokat azonosít mind a nem-klónozott (genomikus), mind a p613 DNS-ben. Ebből következik, hogy most elérjük a gén 3’ végét, amint azt később DNS szekvencia analízissel igazoljuk. 24 A p534 kozmid egyik 0,9 kb nagyságú EcoRI/BamHI töredékéből egy 5’ .séta" vizsgálómintát készítünk. Ez kimutat egy átfedő kozmid kiónt (p612), amely kissé túlnyúlik az átfedő tartományon. A leginkább 5’ felé levő genomikus kiónokat végül úgy kapjuk, hogy a kozmid/4X és a lambda/4X könyvtárakat szűrővizsgálatnak vetjük alá cDNS eredetű vizsgálómíntákkal. Amint az a 4. ábrán látható, a lambda 599, lambda 605 és p624 teljessé teszi a rekombináns kiónok sorozatát, amely átfogja a Vili. faktor génjét. (Ezek a kiónok átfednek és tartalmazzák a humán genom ezen tartományának egész DNS-ét egy 8,4 kb nagyságú hézag kivételével, amely a p624 és a lambda 599 között van, és kizárólag intron DNS-ból áll.) Együttesen, a gén az emberi X kromoszóma 200 kb nagyságú részét öleli át. Ez messze a legnagyobb gén, amelyről eddig beszámoltak. A génnek durván 95%-a intronokból áll, amelyeket megfelelő kezelésnek kell alávetni ahhoz, hogy megfelelő templát mRNS-t kapjunk a VIII. faktor fehérje szintéziséhez. A lambda és kozmid rekombináns kiónokban lévő VIII. faktor géntartomány elkülönítése nem elegendő a hasznos termék, a VIII. faktor fehérje előállításához. Több megközelítést alkalmazunk .a gén fehérjekódoló (exon) részeinek azonosítására és jellemzésére annak érdekében, hogy végül létrehozzunk egy rekombináns kifejező plazmidot, amely képes az aktív VIII. faktor fehérje átfertózött mikroorganizmusokban vagy szövettenyészet sejtekben történő szintézisének irányítására. Két megközelítési móddal nem jutunk gyakorlatilag használható eredményhez: a genomikus kiónoknak fehérje-szekvenciameghatározáson alapuló új oligonukleotid vizsgálómintákkal való további szűrővizsgálatával; és genomikus kiónok kiválogatott töredékeinek vizsgálómintaként való alkalmazásával RNS folthibridizélásokhoz. A VIII. faktor fehérje kódoló tartományokat azonban elkülönítjük SV40 .exonkifejezö" vektorok alkalmazásával, és végül cDNS klónozással. 6. SV40 exonkifejezö vektorok Rendkívül valószínűtlen, hogy egy több száz kb nagyságú genomikus tartomány tökéletesen jellemezhető DNS szekvencia analízissel, vagy közvetlenül felhasználható használható mennyiségű VIII. faktor fehérje szintéziséhez. A humán VIII. faktor génjének durván 95%-a tartalmaz intronokat (beavatkozó szekvenciákat), amelyeket el kell távolitanunk mesterségesen vagy eukarióta RNS összeillesztő szerkezettel, mielőtt kifejezni lehetne a fehérjét. Eljárást fejlesztünk ki az intronok eltávolítására genomikus kiónok tökéletlenül jellemzett restrikciós töredékeiből, SV40 kifejező vektorok alkalmazásával. Az eljárás alapelve szerint genomikus DNS töredé-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
