202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
41 IIU 202275 A 42 ciájával való illeszkedéseket tár fel. Ez azt mutatja, hogy a humán VIII. faktor egy genomikus kiónjának exonjához jutunk. 4. A genomikus kiónok kiterjesztése: lambda könyvtár genomikus séta Kezdetben 8 független VIII. faktor genomikus kiónt kapunk a lambda/4X könyvtárból. Ezek mintegy 28 kb nagyságú átfedő szegmenseket tartalmaznak a humán genomból. A VIII. faktor fehérjéjének feltételezett mérete alapján úgy véljük, hogy a teljes gén 100-200 kb nagyságú részt fog át, az intronok hosszúságától függően. Ezért az átfedő kiónok készletét megnöveljük .genomikus séta" segítségével. Ennél az eljárásnál az első lépés a restrikciós endonukleáz hasítási helyek feltérképezése a meglévő genomikus klónoknál (4. ábra). A klónokból származó DNS-t egy vagy több restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott termékeket gélelektroforézissel jellemezzük, majd egyes esetekben utána Southern-folt hibridizációt végzünk. Az EcoRI és BamHl enzimmel végzett emésztéssel nyert DNS töredékeket az egyszerűség kedvéért pUC plazmid vektorokba [Viera és munkatársai, Gene, 19, 259 (1982)] alklónozzuk. A restrikciós enzimekkel végzett feltérképezés, a DNS szekvencia analízis és a 8.3 mintával végzett folthibridizációk meghatározzák a gén orientációját. Ezután a 28 kb nagyságú tartomány végei közelében lévő, egyetlen példányú töredékeket mint .séta" vizsgálómintákat azonosítjuk. A klónozott DNS emésztésével nyert termékeket folt hibridizációnak vetjük alá 32P izotóppal jelzett teljes humán DNS segítségével. Ezen módszer szerint csak azok a töredékek hibridizálnak, amelyek szekvenciái több, mint körülbelül 50-szer megismétlődnek a genomban [Wood és munkatársai, J. Bioi. Chem., 256, 1502 (1981); Shen és munkatársai, Cell, 19, 379 (1981)]. A nem hibridizáló séta vizsgálóminta töredékeket újra megvizsgáljuk az ismétlődő szekvenciákra vonatkozólag, a lambda/4X könyvtárból származó 50.000 fághoz történő hibridizá)ással. Az 5’ irányban 1 kb nagyságú vizsgáló minta töredékekből álló triplettet különítünk el az Ndel és BamHl enzimekkel emésztett lambda 120 DNS-ból (lásd a 4. ábrát). Egy millió lambda/4X bakteriofágot vetünk alá szűrővizsgálatnak ezzel a vizsgálómintával. Kimutatjuk, hogy egy kapott klón, a lambda 222, mintegy 13 kb értékkel nyúlik túl a lambda 120 5’ részén (lásd a 4. ábrát). A 3’ irányban a lambda 114 egy 2,5 kb nagyságú StuI/EcoRI restrikciós töredékét1 azonosítjuk, mint egyetlen példányban levő .séta vizsgálómintát. A lambda/4X könyvtár, majd azt követően más lambda/emberi genom könyvtárak kimeritó szűrővizsgálatával nem kapunk túlnyúló kiónokat. Korábban már megfigyelték, hogy a genomikus tartományok nincsenek kellőképpen képviselve a lambda könyvtárakban Fritsch és munkatársai, Cell, 19, 959 (1980)]. Úgy döntöttünk, hogy specifikusan dúsítunk genomikus DNS-t a kívánt szekvenciákhoz, és egy korlátozott bakteriofág könyvtárból építjük fel azt. A humán genomikus DNS-nek a 2,5 kb nagyságú StuI/EcoRI vizsgálómintával történő Southern folt hibridizálása egy 22 kb nagyságú, hibridizáló Bell restrikciós töredéket mutat. A restrikciós feltérképezés azt mutatja, hogy ennek a töredéknek a klónozása és kinyerése a genomikus kiónok nagy 3' kiterjesztését eredményezi. Emberi 49.XXXXY DNS-t emésztünk Bell enzimmel, és egy körülbelül 22 kb nagyságú frakciót gélelektroforézissel tisztítunk. Ezt a DNS-t ligáljuk a lambda 1059 bakteriofág vektor BamHl heyébe, és könyvtárat készítünk. (A korábban alkalmazott Charon 30 vektor nem tud befogadni egy ilyen nagy betétet.) Hat hibridizáló kiónt kapunk az ebből a dúsított könyvtárból átvizsgált 400.000 fágból. A kívánt, lambda 482 jelzésű klón 17 kb értékkel nyúlik túl a 3' végen, összehasonlítva az eredeti átfedő genomikus klónjainkkal (4. ábra). 5. Genom .séta': kozmid kiónok Új genom könyvtárat hozunk létre kozmid vektorokkal. A kozmidok [Collins és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 4242 (1978)], amelyek egy plazmid és egy bakteriofág hibridjei, körülbelül 45 kb nagyságú betétet képesek befogadni. Ez körülbelül háromszoros növekedést jelent a lambda/4X DNS könyvtár átlagos betétméretéhez képest. Egy újabban kialakított kozmidvektor, a pGcos4 a következő kívánatos jellemzőkkel rendelkezik: 1. A pBR322 tetraciklinnel szemben rezisztens génjének egy olyan származékát használjuk, amely nem tartalmaz BamHl helyet. Ez lehetővé teszi, hogy a plazmidban máshová elhelyezzünk egy BamHl helyet, és klónozó helyként használjuk azt. A tetraciklinnel szembeni rezisztenciával valamivel könnyebben tudunk dolgozni, mint a gyakrabban alkalmazott ampicillinnel szembeni rezisztenciával, a tetraciklin nagyobb stabilitása következtében. 2. A lambda 403 bázispár nagyságú Hindi töredékével - amely a cos helyet tartalmazza - helyettesítjük a pBR322-nek 641 bázispárból álló Aval/PvuII töredékét. Ilyen módon megnöveljük a plazmid példányszámát, és eltávolítjuk a pBK322 azon szekvenciáit, amelyek zavarják az eukarióta sejtek transzformálását [Lusky és munkatársai, Nature, 293, 79 (1981)]. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 23
