202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
39 HU 203275 A 40 3,3 mM etilén-diamin-tetra-ecetsavat tartalmaz. A diszulfid-kötéseket oly módon redukáljuk, hogy a fenti pufferhez 10 mM ditiotreitolt is adunk. A végső térfogat 1,5 ml. A ciszteineket 15 mikroliter 5M jód-ecetsavval 1 alkilezzük, amelyet 1 M nátrium-hidroxidban oldunk. A reagáltatást 35 percig végezzük szobahőmérsékleten, sötétben, és az alkilezési reakciót úgy állítjuk le, hogy ditiotreitol hozzáadásával 100 mM végső ditiotreitol-koncentrációt állítunk be. A fehérjeoldatot 4 órán ét dializáljuk 0,1 M ammónium-hidrogénkarbonát-oldatban oldott 8 M karbamiddal szemben. A dialízishez használt oldatot fokozatos hígítással változtatjuk meg: a karbamid-koncentrációt 24 óra alatt fokozatosan csökkentjük (8 M, 4M, 2 M, 1 M, végül 0,5 M karbamid-koncentrációt állítunk be). A redukált, alkilezett, 80.000 dalton molekulatömegű fehérjét triptikus emésztésnek vetjük alá TPCK-val kezelt tripszin (gyártó: Sigma Chem. Co.) alkalmazásával. Ennek 60- rán 30 rész VIII. faktor fehérjére 1 rész tripszint veszünk. Az emésztést 12 órán át végezzük 37 °C-on, majd a reakcióelegyet felhasználásig megfagyasztva tartjuk. Az emésztéssel kapott peptideket nagynyomású folyadékkromatográfiéval választjuk szét nagy felbontóképességű Synchropak RP-P C-18 oszlopon (0,46 x 25 cm, 10 mikron), szobahőmérsékleten, Spectra-Physics 8000 kromatográf alkalmazásával. Körülbelül 0,8 ml térfogatú mintákat fecskendezünk be. Az oszlop kifejlesztéséhez 0,1%-os rifluorecetsavban acetonitril-gradienst használunk, amelyben az acetonitril mennyiségét 200 perc alatt 1%-ról 70%-ra növeljük. Az abszorbanciát 210 nm-nél és 280 nm-nél figyeljük (16. ábra). Az egyes csúcsoknak megfelelő frakciókat összegyűjtjük, és 4 °C-on tároljuk, amíg szekvencia-analízisnek nem vetjük alá őket, PTH aminosav-azonosító on-line programmal ellátott, Beckman forgócsészés szekvenciameghatározó segítségével. A körülbelül 23% acetonitril-koncentrációnál eluálódó, a 16. ábrán nyíllal jelölt csúcs az AWAYFSDVDLEK szekvenciájú peptidnek felel meg. Ezt a szekvenciát használjuk a 8.3 oligonukleotid vizsgálóminta kialakításához, a humán genomikus könyvtár szűrővizsgálata céljára. A fentebb kifejtett megfontolások alapján hosszú és rövid mintákat szintetizálunk. A második hosszú minta, amelyet használunk, egy 12 aminosavból álló, a Vili. faktor triptikus hasításánál képződő töredék AWAYFSDVDLEK szekvenciáján alapul. A vizsgólóminta szintéziséhez kiválasztott DNS szekvencia a következő: 5'-CTTTTCCAGGTCAACGTCGGAGAAATAAGCCCAAGC. Ezt a vizsgálómintát (elnevezése 8.3) először genomikus folt hibridizálásában teszteljük. A 3A. ábrán jelzett 8.3 mintával hibridizált és különböző szigorúságok mellett mosott közönséges him (IX) és 49.XXXXY (4X) DNS genomikus Southern-foltjai láthatók. Még a iegna- 22 gyobb szigorúságnál is (lxSSC, 46 °C) csak egyetlen sávot figyelünk meg, amely 3,8 kb nagyságú (EcoRI) és 9,4 kb nagyságú (BamHI). Ennek a sávnak az intenzitása 1:4 körüli aránnyal jellemezhető az IX és 4X mezőben, amint az várható az X-hez kapcsolódó Vili. faktor génnél. Az összehasonlító kísérletek azt mutatják, hogy egy ismert X-hez kapcsolódó gén vizsgáló minta (IX, faktor) a várt 1:4 hibridizációs arányt adja, mig egy autoszom gén (albumin) 1:1 arányt ad. E genomikus foltvizsgálatok eredményei alapján felhasználjuk a 8.3 mintát a lambda/- 4X könyvtár szűrővizsgálatára. 500,000 fágot növesztünk ötven, 150 mm átmérőjű lemezen, és 2-2 párhuzamos nitrocellulóz szűrőt hibridizálunk 32P izotóppal jelzett 8.3 mintával; a mosás szigorúsága lxSSC és 37 °C (3. ábra). Ismételt vizsgálatkor 15 erősen hibridizáló és 15 gyengébben hibridizáló kiónt kapunk. Ezekből az elkülönített tarfoltokból DNS-t állítunk elő, restrikciós endonukleázokkal elhasítjuk és folt-hibridizálásnak vetjük alá 8.3 vizsgálóminta alkalmazásával. Az erősen hibridizáló kiónok közül jó néhány egy 3,8 kb nagyságú hibridizáló EcoRI töredéket szolgáltat. Ugyanezt a méretet a genomikus foltvizsgálatnál is kimutatjuk. Ezen túlmenően, az összes erősen hibridizáló klón egy azonos, 262 bázispárból álló Sau3AI töredéket ad a 8.3 vizsgálómintával történő hibridizációnál. A Sau3AI töredékeket egyszálú M13mp8 fág vektorba [Messing és munkatársai, Nucleic Acids Res., 9, 304 (1981)] klónozzuk, hibridizálással átvizsgáljuk, a szekvenciát a didezoxi-eljárással meghatározzuk. A 262 bázispárból álló töredék jelentős mértékben homológ a 8.3 mintával. Az összesített homológia 83%-os, a homológia 14 és 10 bézispérból álló, folyamatos illeszkedésű területeket is érint. A peptidtőredék első tiz maradéka megegyezik azzal, amelyet a rekombináns kiónok DNS szekvenciájából következtethetünk, és előttük egy lizin kodon helyezkedik el, amint az egy tripszinnel feltárt terméknél várható. Az utolsó két következtetett maradék nem illeszkedik a DNS szekvenciához. Ennél a csatlakozásnál azonban a DNS egy jó konszenzus RNS kapcsolási donor szekvenciát tartalmaz (Breathnach és munkatársai, Ann. Rev. Biochem., 50, 349 (1981); Sharp, Cell, 23, 643 (1981), amelyet rövidesen megállító (STOP) kodonok követnek mindhárom lehetséges keretben. Ez intron jelenlétére mutat, ahol az intron ebben a helyzetben kezdődik. (Ezt a feltevést megerősítik az alábbiakban leirt cDNS kiónok). Egy nyitott leolvasó keret majdnem 400 bázispár távolságra nyúlik a homológia tartományától 5’-feIé. Ebben a tartományban több konszenzus illesztési akceptor szekvenciát azonosítunk. Az erre a tartományra vonatkozó, I)NS-e alapján megjósolt fehérjeszekvencia ellenőrzése a VIII. faktor több további triptikus peptidtóredékének fehérjeszekven-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
