202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
37 HU 202275 A 38 rövid minták használhatóságát bonyolult DNS-szekvenciájú könyvtárak átvizsgálásához. A 24. ábrán négy rövid minta olvadási hőmérsékletét ábrázoljuk szokásos (6xSSC) és 3,0 M TMACl-t alkalmazó mosási körülmények között. 3,0 M TMAC1 esetén a minták olvadása közel lineárisan változik a hosszúsággal, mig 6xSSC közegben az olvadást jelentős mértékben befolyásolja a G-C tartalom. Ezt a következtetést világosan alátámasztja a 13-mer 6xSSC-ben tapasztalt magas olvadási hőmérséklete, mivel ebben az esetben a G-C tartalom 65%. A 2B. ábrán a 3,0 M TMACl-ben mért olvadási hőmérséklet látható a 11 és ezer közötti bázishosszúság függvényében. Ez az’ ábra lehetővé teszi a hibridizációs körülmények gyors kiválasztását bármilyen kivánt hosszúságú, pontos illeszkedésü vizsgálóminta esetén. A TMAC1 hibridizációs eljárás igen jól használható minden olyan esetben, amikor ismert hosszúságú, pontos szekvenciailleszkedésre van szükség. Példák erre a módszerre: 1. Humán genomikus könyvtár szűrővizsgálata 16-17-merek keverékével. 3,0 M TMACl-es mosást alkalmazunk 50 °C-on, ami csak 17, 16 és néhány 15 bázisos szekvencia hibridizációját teszi lehetővé. Ilyen módon kizárjuk az alacsonyabb homológiájú, nagy számú, nagy G-C tartalmú vizsgálómintákat. 2. Ha egy rövid vizsgálómintával végzett szűrővizsgálatnál túlságosan sok pozitiv eredményt kapunk ahhoz, hogy könnyen meg lehessen a szekvenciát állapítani, a legvalószínűbb jelölteket TMACl-es olvasztási módszerrel találhatjuk meg. A pozitív eredményt adó minták másolatait hibridizáljuk, és mossuk, mindig 2 °C értékkel emelve a hőmérsékletet (17-merek esetén, amelyek 54 °C-on olvadnak, 46, 48, 50, 52, 54 és 56 °C értéket alkalmazunk). 3. Hasonló módon, ha egy hosszú vizsgálómintával végzett szűrővizsgálatnál túlságosan sok pozitiv eredményt kapunk, ugyanolyan fehérjeszekvencián alapuló rövid vizsgálóminták keverékét szintetizálhatjuk. Mivel a keveréknek az egyik tagja tökéletes illeszkedést is tartalmazhat, a TMAC1 alkalmazásával végzett olvasztási kísérletekkel finomíthatjuk a legmegfelelőbb pozitiv erdményt adó vizsgálóminta kiválasztását. 4. Helyre irányuló mutagenezisnél olyan oligonukleotidot szintetizálunk, amely általában 20 hosszúságú, és 1 vagy több változást tartalmaz a központban. A TMACl-es mosó eljárással könnyen megkülönböztethetjük a szülő és a mutáns származékokat, még akkor is, ha egy 20-mer közepén csak 1 hibás illeszkedési bázis van. Ez annak köszönhető, hogy a kivánt mutáció pontosan illeszkedik a vizsgálómintához. A mosási körülményeket egyszerűen meghatározhatjuk a 2B. ábráról. 5. Egy adott gén kiválasztása igen hasonló gének közül. A fentebb leírthoz igen hasonló olvasztó kísérletet alkalmazunk egy adott génnek 100 nagyon hasonló szekvenciájú gén közül történő kiválasztásához. 3. A VIII. faktor genomikus klón első elkülönítése VIII. faktorban dúsított készítményeket állítunk elő emberi vér krioprecipitátumból polielektrolit kromatográfiával és immunadszorpcióval a korábban leírtak szerint [Tuddenham és munkatársai, Symposium on Factors VIII/von Willebrand Factor, 1982. október 7-9, 1. oldal]. Ezt az anyagot 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot és 1% ammónium-hidrogén-karbonétot tartalmazó oldattal szemben dializáljuk, liofilizáljuk és felhasználásig -20 °C-on tároljuk. Mivel a VIII. faktort tartalmazó készítményeket más vérplazmafehérjék szennyezik, további frakcionálásra van szükség ahhoz, hogy tisztítsuk a VIII. faktort és elválasszuk a különféle polipeptidláncokat, amelyek valószínűleg a Vili. faktortól származnak. Ezt a frakcionálást a fehérje kromatográfiájával végezzük el, Toya Soda TSK 4000 SW oszlopokon, nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével, nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében. Ennél a kromatográfiánál a molekulaméret alapján választjuk szét a fehérjéket. A liofilizált fehérjét felhasználás előtt desztillált vízhez adjuk, majd 1%-os nárium-dodecil-szulfát-tartalmat és 0,1 M nátrium-foszfát-tartalmat állítunk be (pH=7,5). A TSK oszlopot (0,75 x 50 cm; gyártó: Alltech, Deerfield, Illinois) szobahőmérsékleten egyensúlyba hozzuk 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,1 M nátrium-foszfát-oldattal (pH= =7,0). 0,15-0,25 ml térfogatú mintákat fecskendezünk be az oszlopba, és az oszlopot izokratikusan fejlesztjük ki 0,5 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az abszorbanciát 280 nm-nél vizsgáljuk, és 0,2 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Egy jellegzetes elúciós profilt a 15. ábra mutat be. Az alikvot részeket nátrium-dodecil-szulfátos gélelektroforézissel analizáljuk, ahol a gélek poliakrilamid tartalmát 5%-ról 10%-ra növeljük; majd megfestjük ezüsttel [Morrissey Anal. Biochem., 117, 307 (1981)], és így elemezzük. A 25 perc elteltével eluált anyag egy fehérjekettósnek felel meg, 80.000 és 78.000 D értékkel. Az ezeket a fehérjéket tartalmazó frakciókat egyesítjük, amint azt a vonal mutatja a 15. ábrán, három különálló preparatív TSK sarzsból, és az elegyet felhasználásig -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A TSK oszloppal végzett frakcionálással nyert tisztított, 80.000 dalion molekulatömegű fehérje 0,8 nanomól mennyiségét egy éjszakán át dializájuk nitrogénatmoszférában egy olyan oldattal szemben, amely 8 M karbamidot, 0,36 M trisz-hidrokloridot (pH=8,6) és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 21
