202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
35 36 HU 202275 A (cob) sejtjeinek átfertózése után átírt RNS-t in vivo alakítjuk, és ez a cDNS kiónok alternatív forrása lehet a rekombináns VIII. faktor fehérje termeléséhez. A fenti eljárás tényleges kivitelezésekor a cDNS kiónokból, különféle típusú genomikus kiónokból és SV40 rekombináns .exontermeló' kiónokból származó információk is szerepet játszottak. Ezekkel az alábbiakban külön foglalkozunk. 2. A genomikus könyvtár átvizsgálása Ismeretes, hogy a VIII. faktor génje az emberi X kromoszómán helyezkedik el iZimmermari és munkatársai idézett munkája.) A pozitív kiónok részarányának növelésére genom könyvtárat hozunk létre 4X kromoszómákat tartalmazó egyénből kinyert DNS-ből. (A limfoblaszt sejtvonal 49.XXXXY kariotipusú; az ebből a DNS-ből létrehozott könyvtárat a leírásban a továbbiakban 4X könyvtárnak nevezzük.) A 49.XXXXY DNS-t részlegesen emésztjük Sau 3AI enzimmel, és a megfelelő méretű frakciókat ligáljuk lambda fág vagy kozmid vektorokhoz. Az alábbiakban ismertetjük ezeknek a lambda/4X és kozmid/4X könyvtáraknak a létrehozásával kapcsolatos részleteket. A VIII. faktor génjének a várható gyakorisága a lambda/4X könvtárban körülbelül egy, 110.000 klón közül, a kozmid könyvtárban pedig körülbelül egy, 40.000 klón közül. Ezeket a könyvtárakat szűrővizsgálatnak vetjük alá a VIII. faktor génjére vonatkozólag, a VIII. faktor fehérjeszekvencia részletein alapuló, szintetikus oligonukleotid vizsgálóminták segítségével. Ezek az oligonukleotid vizsgálóminták két típusba sorolhatók: 30-100 nukleotidból álló egyedi szekvencia, amely a kódon kiválasztás alkalmazásán alapul (hosszú minták); és 14-20 nukleotid hosszúságú vizsgáló minták keveréke, amely minden lehetséges degenerációs kombinációnak megfelel az egyes kódonok kiválasztásánál (rövid minták). A hosszú minták fő előnye az, hogy a fehérje bármelyik, 10-30 aminosavat tartalmazó szekvenciája alapján szintetizálhatok. Nincs szükség kis kódonbóségü különleges részekre. Egy másik előny az, hogy mivel nincs szükség a génszekvenciával való pontos megfelelésre (csak 10-14 nukleotid komplementer egyezésü szakaszokra van szükség), az alkalmas hibridizációt nem akadályozza meg szükségszerűen, ha a komplementaritás megszakad intron jelenléte folytán, vagy génpolimorfizmus vagy fehérjeszekvencia-hiba van jelen. A hosszú minták hátránya viszont, hogy mindössze egy kodon kiválasztása történik meg minden egyes aminosavra. A kodonok kiválasztásánál egy, az emlősöknél tapasztalható kódongyakoriságra vonatkozó táblázatot használunk [Grantham és munkatársai, Nuclei Arts Res., 8, r49 (1980)], és ha ebből nem derül ki világosan, hogy mit részesítünk előnyben, a IX. faktor génjének kodon-gyakoriságát vesszük figyelembe [Kurachi és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 5 USA, 79, 6461 (1982)]. Mivel a hosszú minták várt szekvencia-illeszkedését nem ismerjük, minden egyes vizsgálómintánál empirikusan kell meghatároznunk a hibridizáció szigorúságát. Ebből a célból a hibridizációt genomi- 10 kus DNS foltokkal, valamint a mosás különböző szigorúságokkal végezzük. A rövid vizsgálóminták előnye az, hogy mindegyik lehetséges kodon oligonukleotidok keverékeként szintetizálható. Ha tehát az 15 aminosav-szekvencia helyes, egy rövid vizsgálóminta mindig hibridizálódik a számunkra fontos génnel. A fő korlátozás a szintetizálható szekvenciakeverék összetett volta. A működés szempontjából 32 különféle szekven- 20 ciából álló keverék tekinthető a maximális keverékméretnek, tekintetbe véve a genomikus könyvtárhoz történő hibridizáció jel/zaj arányából adódó korlátozásokat. Ez azt jelenti, hogy csak a kis kodonbóségű tartomá- 25 nyokban levő fehérjeszekvenciák alkalmazhatók. Egy jellegzetes vizsgáló minta 16-17-merek keveréke, amely valamennyi lehetséges szekvenciának megfelel egy 6 aminosavból álló fehérjeszekvencia-tőredéknél. 30 Ugyanúgy, mint a hosszú mintáknál, empirikusan határozzuk meg a rövid vizsgáló mintákhoz használt hibridizációs szigorúságot. Ennek oka az, hogy a szokásos hibridizációs körülmények között (6xSSC) a hibri- 35 dek stabilitása két tényezőtől függ: a hoszszúságtól és a G-C tartalomtól. A kis G-C tartalmú vizsgálóminták esetén szigorú körülmények egyáltalán nem szigorúak a nagy G-C tartalmú vizsgáló mintákra vonatkozólag. 40 16-17-merek szokásos keverékében a G-C-tartalom 41-65%, és ezek a vizsgálóminták 6xSS0-ben 10 °C nagyságú hőmérséklet-tartományon belül (48-58 °C között) olvadnak meg. Mivel a 16-os keveréken belül nem is- 45 merjük előre a helyes szekvenciát, közvetlenül 48 °C alatti hibridizációs szigorúságot használunk, hogy a legkisebb G-C tartalmú szekvencia is hibridizálódjék. Amikor azonban nagy számú klón szűrővizsgálatát végez- 50 zük el, ez a megoldás sok hamis pozitív eredményt ad rövidebb hosszúság és nagyobb a G-C tartalom esetében. Mivel az olvadási hőmérséklet változása bázispár-illeszkedésenként 1-2 °C, azok a vizsgálóminta- 55 -szekvenciák, amelyek 12 vagy 13 szekvenciát tartalmaznak a 17-ból, szintén kötődnek, ha nagy a G-C tartalmuk. Általában az emberi genomban 16-17-merek keverékéből álló vizsgálóminta 1200-szor annyi 13 tagú bázis- 60 szekvenciával hibridizál, mint 17 tagú bázisszekvenciával. Olyan hibridizációs módszert fejlesztettünk ki a rövid vizsgálómintákra, amely egyensúlyba hozza a G-C és A-T bázispárok 65 stabilitását, és jelentős mértékben növeli a 20
