202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
21 HU 202275 A 22 Az RNS Northern-folt hibridizációjának befejezése után elektroforézist végeztünk 6% formaldehidet tartalmazó agaróz gélen [Maniatis és munkatársai idézett munkája; Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 5794 fi (1980)]. Radioaktiv izotóppal jelzett vizsgálómintákat készítünk úgy, hogy 32P izotóppal jelzett, nagy fajlagos aktivitású nukleotid Lrifoszfátok (32P: Amersham; Klenow-féle DNS 10 poliineráz; BRL, NEB vagy Boehringer-Mannheim) alkalmazásával véletlenszerű borjú-csecsemőmirigy DNS-sel beindított szintézist végzünk [Taylor és munkatársai, Biochem. Biophys. Acta, 442, 324 (1976)]. A rövid öli- 15 gonukleotid vizsgálómintákat a végükön megjelöltetjük T4 polinukleotid kináz segítségével. A .standard sós’ Southern-féle hibridizáció körülményei: hibridizáció 5 x SSC ol- 20 datban (1 x SSC oldat összetétele: 0,15 M nátrium-klorid és 0,015 M trinátrium-citrát,), 50 mM nátrium-foszfát (pH=7), 10%-os dextrán-szulfát, 5x Denhardt-oldat (lx Denhardt oldat összetétele: 0,02% ficoll, 0,02% polivinil- 25 -pirrolidon, 0,02% szarvasmarha szérum albumin), 20-100 Mg/ml denaturált lazacsperma DNS és 0-50% formamid jelenlétében, 24-42 °C közti hőmérséklet-tartományban, majd mosás 0,2-lx SSC oldatban, amely 0,1% nátrium-do- 30 decil-szulfátot is tartalmaz, 24-65 °C közötti hőmérséklet-tartományban. A megszáritott szűrőkkel Kodak XAR filmet exponálunk -80 °C-on, DuPont .Lightning-Plus’ erősítő szűrők alkalmazásával. (Lásd általában Mania- 35 tis és munkatársai idézett munkáját]. A sejt- és szövet-ribonukleinsavak Northern-féle foltvizsgálatához a hibridizációt az alábbi közegben végezzük: 5x SSC, 5x Denhardt-féle oldat, 10% dextrán-szulfát, 50% 40 formamid, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát, 0,1% nátrium-pirofoszfót, 0,1 mg/ml Escherichia coli tRNS. A 42 °C-on egy éjszakán át kivitelezett hibridizációhoz egy 32P izotóppal jelzett mintát használunk, amely a lambda 45 120 A exon szekvenciát tartalmazó, 189 bázispárból álló Stul/HincI töredékéből készült. A mosást 42 °C-on végezzük 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,2x SSC oldattal. Emberi DNS-t készítünk perifériás vér 50 limfocitákból (46,XY) vagy lirafoblaszt sejtekből (49,XXXXY, N.I.G.M.S. Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, N.J., deponálás száma GM1202A) [Maniatis és munkatársai idézett müve]. Escherichia coli plazmid DNS-t 55 és bakteriofág lambda DNS-t állítunk elő a Maniatis és munkatársai munkájában megadott módon. Szöveti RNS-t állítunk elő, vagy a guanidin-tiocianátos módszerrel [Maniatis és munkatársai idézett munkája; Ullrich és 60 munkatársai, Science, 196, 1313 (1977)], vagy Goldberg módszerével [Goldberg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 5794 (1980)J. A poliadenilezett RNS-t oligo (dT) cellulózon különítjük el [Aviv és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 1408 (1972)]. A DNS szekvencia-analízist Sanger és munkatársai módszerével végezzük [Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71, 5463 (1977)]. A lambda/4x könyvtárhoz a 49, XXXXY DNS öt, 50-50 pg mennyiségű alikvot részét emésztjük Sau3AI enzimmel, 1 ml térfogatban, 3,12; 1,56; 0,782; 0,39 és 0,195 egység/ml enzimkoncentráció alkalmazásával, 37 °C-on. Az emésztést 1 órán át végezzük. A próbaemésztés és a gélanalizis azt mutatja, hogy ilyen körülmények között, 0,782 egység/ml Sau3AI-koncentráció esetén a DNS tömeg szerinti átlagos mérete körülbelül 30 kb. így ezek az emésztések 15 kb körül elhelyezkedő átlagos számszerű eloszlást adnak. Az öt emésztésből nyert DNS-t egyesítjük, fenollal és kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és elektroforézisnek vetjük alá 6g/l koncentrációjú, alacsony gélesedési hőmérsékletű, vízszintes agaróz gélen [Maniatis és munkatársai idézett munkája] (Seaplaque agaróz, FMC Corp.), két 5,6 x x 0,6 x 0,15 cm nagyságú lemezen. A 12- -18 kb részt tartalmazó géldarabot kivágjuk, és a DNS-t a gélszelet megolvasztásával tisztítjuk a Maniatis és munkatársai által leirt módon. Charon 30 karokat készítünk oly módon, hogy a vektor 50 Mg mennyiségét emésztjük BamHI enzimmel, és elkülönítjük a 31,9 kb nagyságú kar-töredéket egy 6 g/1 koncentrációjú, alacsony gélesedési hőmérsékletű agaróz gélről a fentebb ismertetett módon. A lambda/4X könyvtár kialakításához a Charon 30 BamHI karok és a 12-18 kb nagyságú Sau3A részleges 49, XXXXY DNS optimális koncentrációját a Maniatis és munkatársai által leirt módon határozzuk meg. A ligáit DNS-t egy in vitro extraktumba .csomagoljuk’ (.Packagene’,) gyártó: Promega Biotec, Inc., Madison, WI). Egy szokásos reakcióban mintegy 1,3 Mg Charon 30 BamHI kart ligálunk 0,187 Mg mennyiségű, 12-18 kb nagyságú Sau3A DNS betéttel 10 m1 térfogatban. A DNS lemezre vitelével, becsomagolva körülbelül 1,3 x 106 fág tarfoltot kapunk. A lambda/4X könyvtár kialakításához 1,7 x 106 fágot szélesztünk, mégpedig 17000 fágot 150 mm-es lemezenként. Ezeken a lemezeken egy éjszakán át folytatunk szaporítást, majd egy olyan közegbe kaparjuk, amely 10 mM trisz-hidrokloridot (pH=7,5), 0,1 M nátrium-kloridot, lüniM magnéziura-kloridot és 0,5 g/1 zselatint tartalmaz, majd rövid ideig centrifugáljuk, mindezt a fág erősítése érdekében. Általában alkalmas számú fágot (0,5-2 x 106) viszünk át lemezre, és vetünk alá a vizsgálatoknak [Maniatis és munkatársai idézett munkája]. Egyes esetekben a ligáit és in vitro csomagolt fágot erősítés nélkül, közvetlenül vetjük alá a vizsgálatoknak. 13
