202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
23 HU 202275 A 24 A lambda 482 elkülönítéséhez a VIII. faktor genom 22 kb nagyságú Bell töredékét és a lambda 1059 vektor BamHI kar töredékeit tartalmazó kiónt különítjük el gélelektroforézissel [Karn és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 5172 (1980)}. A 49.XXXXY sejtvonaltól származó 100 /jg DNS-t emésztjük Bell enzimmel, és a 20-24 kb nagyságú frakciót gélelektroforézissel elkülönítjük. Mintegy 0,8 ug lambda 1059 kar-töredéket és 5% elkülönített Bell DNS-t ligálunk 10 pl térfogatban, és igy 712 000 tarfoltot hozunk létre [Maniatis és munkatársai idézett munkája]. Közülük négyszázezret vizsgálunk meg 2,2 kb nagyságú, a lambda 114-ből származó StuI/EcoRI vizsgáló mintával, 2-2 párhuzamos méréssel. A kozmid/4X könyvtárat a lambda/4X könyvtár kialakításához használt 49.XXXXY DNS-ből hozzuk létre, azzal az eltéréssel, hogy nagy gondot fordítunk a DNS elkülönítésénél a nyírás vagy más szakadás elkerülésére. A DNS-t részlegesen elhasitjuk a Sau3AI enzim öt különböző koncentrációjának alkalmazásával, és az egyesitett DNS-t méret szerint szétválasztjuk 100-400 g/1 szacharóz-grádiens alkalmazásával [Karn és munkatársai idézett közleménye], A 35-45 kb nagyságú DNS-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, dializáljuk, és etanollal kicsapjuk. ' A pGcos4 kozmid vektor kar-töredékeit ismert elvek szerint állítjuk elő [Ish-Horovitz és munkatársai, Nucl. Acids Res., 9, 2989 (1981)]. Röviden, a pGcos4 kozmid vektor két különálló, egyenlő alikvot részét szétvágjuk Sstl enzimmel (amely a Sacl izoskizomerje) vagy Sáli enzimmel, majd pedig bakteriális lúgos foszfatázzal kezeljük. Ezeket az alikvot részeket ezután fenollal és kloroformmal extraháljuk, egyesítjük, etanollal kicsapjuk és BamHI enzimmel szétvágjuk. Ebből a feltárásból a 4394 és 4002 bázispárból álló kar-töredéket különítjük el alacsony gélesedési hőmérsékletű agaróz gélen. Ezeket a kar-töredékeket ezután ligáljuk az elkülönített, Sau3AI enzimmel részlegesen emésztett, 40 kb nagyságú DNS-hez. Egy szokásos reakciónál 0,7 /ug mennyiségű pGcos4 kartöredéket ligálunk 1 Mg mennyiségű, 40 kb méretű, humán 4X DNS-hez 10 m1 térfogatban [Maniatis fenti munkája]. A reakcióelegyet ezután in vitro becsomagoljuk, és felhasználjuk Escerichia coli HB101, egy recA" törzs megfertőzésére [Maniatis idézett munkája]. Ez a reakció mintegy 120.000 telepet hoz létre tetraciklint tartalmazó lemezekre történő átvitel esetén. Körülbelül 150.000 kozmidot vizsgálunk át, 20 darab 150 nim-es lemezen, 2-2 párhuzamos méréssel, a leirt módon, egy éjszakán át erősítést végezve kloramfenikol-tartalmú lemezeken [Maniatis és munkatársai idézett munkája]. Kétszálú cDNS-t állítunk elő a korábban leírt módon [Goeddel és munkatársai, Nucleic Acids Res., 4057 (1980); Capon és munkatársai, Nature, 304, 507 (1983)], vagy oligo(dT)- 12-18-at vagy szintetikus dezoxioligonukleotid 16-mereket (hexadekamereket) használva primerekként az első szál szintéziséhez reverz transzkriptáz alkalmazásával. Poliakrilamid géleken történő elkülönítés után a megfelelő méretű (rendszerint 600 bázispár nagyságú vagy nagyobb) cDNS-t vagy C farokkal látunk el terminális transzferázzal, hozzákapcsolunk G farokkal ellátott, PstI enzimmel emésztett pBR322 plazmidot, és Escherichia coli DH1 törzsbe transzformáljuk [Hanahan, J. Mól. Bioi., 166, 557 (1983)], vagy pedig 100-szoros mólfeleslegben vett szintetikus DNS EcoRI adapterekhez ligáljuk, újból elkülönítjük poliakrilamid gélen, ligálással beillesztjük EcoRI enzimmel emésztett lambda GT10-be, fág részecskékbe csomagoljuk és Escherichia coli C600hfl törzsön szaporítunk [Huynh és munkatársai, Practical Approaches in Biochemistry, ORL Press Ltd., Oxford, England, 1984J. A szokásos eljárások módosításaként egy kiegészítő szintetikus DNS 18-mert és 22- -mert (5’-CCTTGACCGTAAGACATG és 5’AATTCATGTCTTACGGTCAAGG) tartalmazó adaptert foszforilezünk a tompa végén - azonban az EcoRI kohéziv végén nem, és ilyen módon hatékonyan ligáljuk az adaptert a kétszálú cDNS-val anélkül, hogy jelentős mértékű önösszekapcsolódás következne be az EcoRI helyen. Ezáltal eredményesen helyettesítjük azt a munkaigényes eljárást, amelynél önkiegészitő EcoRI kapcsolókat ligálnánk az EcoRI metiláz enzimmel kezelt kétszálú cDNS-hez, majd pedig EcoRI enzimmel végzett emésztéssel eltávolítanánk a kapcsoló oligomerek feleslegét a cDNS végződésekből. Annak érdekében, hogy növeljük a 3500 bázispárnál nagyobb cDNS kiónok kinyerésének hatékonyságát - amely kiónok a poli(A)—tói a genomikus klónozással hozzáférhetővé tett, 3’ irányban legközelebbi Vili. faktor vizsgálóminta szekvenciáig terjednek, (vagyis A exon) -, a második szál cDNS szintézisét specifikusan beindítjuk oly módon, hogy egy B exorion belüli szekvenciának megfelelő szintetikus DNS 16-mert iktatunk be a reakcióba az mRNS .értelmes' (sence) szálon. D. Adenovirus alklónozás Az adenovirus 2 DNS-t a Bethesda Research Laboratories (BRL) cégtől szerezzük be. A vírusos eredetű DNS-t HindlII enzimmel elhasitjuk, és elekLroforézisnek vetjük alá 5%-os poliakrilamid gélen (TBE puffer). A HindlII B töredéket tartalmazó gélrészt [Gingeras és munkatársai, J. Bioi. Chem., 257, 13475 (1982)] kimetsszük, és a DNS-t elektroeiúcióval eltávolítjuk a gélből. Fenollal és kloroformmal végzett extrakció után etanolos 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
