202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
1 2 HU 202275 A A találmány tárgyát a humán VIII. faktor, ennek új formái, az ezt tartalmazó készítmények, továbbá a humán Vili. faktor funkciós származékainak előállítására szolgáló eljárás képezik, elsősorban DNS rekombinációs tech- 5 nológiával. A találmány részben a humán VIII. faktor és az ennek molekulájához hasonló szerkezetű, biológiailag aktivnak bizonyult anyagok DNS szekvenciájának ismeretén és az 10 ebből következtetett aminosav-szekvenciák ismeretén alapul. Ehhez a felismeréshez az vezetett, hogy eredménnyel járt a VIII. faktor különböző formáinak előállítására a DNS rekombinációs 15 technológia alkalmazásával, és ezáltal megfelelő minőségben és mennyiségben termelhettük ezeket az anyagokat a biológiai vizsgálatokhoz és a biológiai aktivitás bebizonyításához. Ezeknek az ismereteknek a birtokában 20 tetszés szerint állíthatjuk elő a VIII. faktor megszabott származékait génmanipuláció útján és in vitro feldolgozással. Ilyen módon hatékonyan termelhetjük az aktiv VIII. faktor származékait olyan mennyiségben, amely 25 korábban elérhetetlen volt. Az érintetlen érrendszer fenntartása sokféle sejt és fehérje kölcsönhatását igényli. Az érrendszer sérülésekor egy sor reakció indul be a folyadék veszteség megakadó- 30 lyozása érdekében. Az első válasz a vérlemezkék aktiválása: a vérlemezkék a sebhez tapadnak és egy sor reakción mennek át. E reakciók közé tartoznak a következők: más vérlemezkék odavonzása, szerves vegyületek 35 és fehérjék felszabaditása, valamint trombogén felület kialakítása a véralvadási reakciósor (kaszkád) aktiválásához. A végbemenő reakciók együttes eredményeként dugó képződik a vérlemezkékből, amely elzárja a se- 40 bet. A vérlemezkékből álló dugót az stabilizálja, hogy fibrinszálak jönnek létre körülötte, s ezek megakadályozzák a nem kívánt folyadékveszteséget. Ahogy a seb gyógyul, a vérlemezkékből álló dugó és a fibrinváz las- 45 san feloldódik. (Részletesebb áttekintést ad a következő kiadvány: Hemostasis and Thrombosis, szerkeszti Bloom és Thomas, Churchill, Livingstone, N.Y., 1981). A vérzés megállításánál kritikus tényező 50 az alvadási reakciósor aktiválása a kezdeti vérlemezke-dugó stabilizálása érdekében. Ez a rendszer több, mint egy tucat fehérje kölcsönhatásából áll; e fehérjék részben a plazmában vannak jelen, részben felszabadult 55 és/vagy aktivált sejtfehérjék [Davie és munkatársai, Ann. Rev. Biochem., 44, 799 (1975); Jakson és munkatársai, Ann. Rev. Biochem., 49, 767 (1980)]. A reakciósorban lejátszódó minden 60 egyes lépés során valamelyik proteáz egy specifikus inaktiv (zimogén) alakja a katalitikusán aktív formává aktiválódik. Nemzetközi megegyezés alapján a reakciósor mindegyik fehérjéjét római számmal jelöljük meg 65 [Wright, J. Am. Med. Assoc., 170, 325 (1959)]. Az illető proteáz zimogén alakját a római szám jelzi, míg az aktivált formánál a római szám után egy .a' alsó indexet írunk. A reakciósor minden egyes lépésénél a proteáz aktivált alakja aktiválja a reakciósor következő lépésében résztvevő proteázt. Ilyen módon egy kis kezdeti inger, amely a reakciósor elején fehérjeaktiválást eredményez, mindegyik lépésnél katalitikusán felerősödik úgy, hogy végül robbanásszerűen képződik trombin, és ez utóbbi hatására az oldható fibrinogén fehérje oldhatatlan fibrinné alakul át. A fibrinnek az a tulajdonsága, hogy önmagához tapadva szálakat vagy rostokat képez. Ennek az a szerepe, hogy stabilizálja a vérlemezkékből létrejött dugót és így az nem mozdítható el könnyen a helyéről. Az 1. ábrán összefoglaltuk a véralvadásban szerepet játszó fehérjék kölcsönhatásaival kapcsolatos jelenlegi ismereteinket. A reakciósorban szerepet játszó bármelyik fehérje hiánya azzal járna, hogy megáll a fibrinképzódést célzó kezdeti inger továbbterjedése. Az 1. ábrán bemutatott reakciósor közepén található egy olyan lépés, amelyben a IXa. faktor hatására a X. faktor altivált formává, a Xa. faktorrá alakul át. Jelenleg úgy vélik, hogy a VIII. faktor (amelyet VIIIC. faktornak is neveznek,) részt vesz ebben a lépésben, foszfolipid és kalciumionok, mint kofaktorok jelenlétében, az nem ismeretes, hogy önmagukban is szerepük lenne, így csak azért van rá szükség, hogy növelje a IXa. faktor aktivitását. Ez a lépés a reakciósorban kritikus, mivel megállapították, hogy két leggyakoribb vérzékenységi panaszt a VIII. faktor csökkent működése (A. vérzékenység vagy klaszszikus vérzékenység) vagy pedig a IXa. faktor csökkent működése (B. vérzékenység) okozza. A vérzékenységgel kapcsolatos rendellenességeknek közelítőleg 80%-a a VIII. faktor elégtelen mennyiségének a következménye. A betegségtünetek mindkét vérzékenységtipusnál azonosak: nem képződik elegendő fibrin a vérlemezkékből álló dugó stabilizálásához, ezért a dugó könnyen elmozdul a helyéről, és ennek következtében a vérzés újból megindul. Az a tény, hogy a VIII. faktor és a IX. faktor hiánya viszonylag gyakran fordul elő a véralvadás során lejátszódó reakciósorban résztvevő többi faktor hiányához képest, annak a következménye, hogy genetikailag az X kromoszómával vannak kapcsolatban. A VIII. faktorra vagy a IX. faktorra vonatkozó gén egyetlen hibás allélje vérzékenységet okoz férfiaknál, akiknél az X kromoszóma csak egyetlen példányban található meg. A többi véralvadási tényező autoszomálisan összekapcsolt, és általában két hibás alléi jelenlétére van szükség ahhoz, hogy zavar lépjen fel a véralvadásnál - ez lényegesen kevésbé gyakori. Ezért az 3
