202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
3 HU 202275 A 1 A. és B. vérzékenység messze a leggyakoribb örökletes véralvadási rendellenesség, amely szinte kizárólag férfiaknál fordul elő. Néhány évtizeddel ezelőtt a vérzékenységben szenvedő emberek általában 20 éves koruk előtt meghaltak. Az 1950-es évek eleje és az 1960-as évek vége közötti időszakban a Vili. faktor által kiválasztott rendellenesség kutatása azt eredményezte, hogy az A. vérzékenységet kezdetben egész vérplazmával, később pedig a Vili. faktor koncentrátumaival gyógyították. A humán VIII. faktor egyetlen forrása az emberi vérplazma volt. A költségekhez hozzájáruló egyik tényező a nagy mennyiségű, felhasználható vérplazma megszerzésével kapcsolatos kiadások. A gyártó cégeknek véradó központokat kell létrehozniok, a véradóknak fizetni kell, s a vérplazmát fagyasztott állapotban kell tartani közvetlenül a vérvétel utáni időponttól egészen a feldolgozóüzembe szállításig. Több, mint ezer véradótól vett vérplazmát egyesítenek, és az így kapott mennyiséget dolgozzák fel. Tekintettel arra, hogy a VIII. faktor aktivitása instabil, nagy veszteségekkel jár az a néhány egyszerű tisztitó művelet, amellyel a koncentrátumokat előállítják (az eredeti aktivitásnak mindössze mintegy 15%-a marad meg). Az ilyen módon előállított gyógyászati termékek igen szennyezettek, a fajlagos aktivitásuk 0,5-2 VIII. faktor egység per mg fehérje (egy VIII. faktoraktivitás-egység definíció szerint az az aktivitás, amely az Egészségügyi Világszervezet (WHO) által standardként elfogadott humán vérplazma minta 1 ml-jében jelen van). A VIII. faktort tartalmazó koncentrátum becsléssel meghatározott tisztasága közelítőleg 0,04 tömeg% VIII. faktor fehérje. Ezt a nagyfokú szennyezettséget sokféle súlyos szövődmény is kiséri, ezek között találjuk a fehérje-kicsapódást, a hepatitiszt; és feltehetően jelen van az az anyag is, amely a szerzett immunhiány szindrómáért felelős. A VIII. faktort tartalmazó koncentrátumokkal kapcsolatos fenti hátrányok okai tehát a következők: a vérplazma-eredetű VIII. faktor instabil, kevéssé tiszta és nagy számú véradótól származik. Ez azt jelenti, hogy ha az ezer véradó közül csak egy is hepatitiszben szenved például, akkor a teljes vérplazmamennyiség a vírussal szennyezetté válik. A véradókat előzetesen megvizsgálják, hogy van-e a vérükben hepatitisz B, ismeretes azonban, hogy a koncentrátumokban néha jelen van mind hepatitisz A, mind pedig hepatitisz nem-A nem-B is. A nagyobb tisztaságú termék előállítására irányuló próbálkozások elfogadhatatlanul nagy aktivitásveszteségeket eredményeznek, növelve ezáltal a költséget. A VIII. faktor tisztításának története megvilágítja azt, hogy milyen nehézségekbe ütközik az ezzel a fehérjével történő munka. Az okok közül elsősorban a VIII. faktor instabilitását és azt emelhetjük ki, hogy a teljes vérben valójában csak nyomnyi mennyiségekben van jelen. Az 1970-es évek elején leírtak egy olyan fehérjét, amelyről akkor feltételezték, hogy az a VIII. faktor [Schmer és munkatársai, J. Bioi. Chem., 247, 2512 (1972); Legaz és munkatársai, J. Bioi. Chem., 247, 3946 (1973); Shapiro és munkatársai, J. Clin. Invest., 52, 2198 (1973)]. E fehérjéről megállapították, hogy egy glikoprotein alegység aggregátuma, ahol az alegység molekulatömege közelítőleg 240.000 dalton, nátrium-dodecil-szulfát (SDS) gélelektroforézissel meghatározva. Ez az alegység nagyobb molekulatömegű, heterogén populációhoz aggregálódott (e heterogén populáció molekulatömege 1 millió és 20 millió dalton közötti tartományban van). A feni fehérje megtalálható volt vérzékenységben szenvedők vérplazmájában, hiányzott azonban a von Willebrand-kórban szenvedő betegek vérplazmájából - ez a betegség autoszomálisan közvetített genetikai rendellenesség, amelyet hosszú vérzési idő és igen csekély mennyiségű VIII. faktor jelenléte jellemez [Nilsson és munkatársai, Acta Med. Scand., 159, 179 (1957)]. Az akkor kidolgozott elmélet szerint ez a nagymolekulatömeg ű fehérje - amelyet von Willebrand-faktornak (vWF) vagy VIII. faktorral rokon antigénnek (FVIIIRAg) neveztek - volt a felelős a véralvadási zavarért mindkét betegségnél, ahol a von Willebrand-kór esetén ez a fehérje nem volt jelen, mig a klasszikus vérzékenységi állapotokban valamiképpen működésképtelen volt [McKee, Ann. NY Acad. Sei., 240, 8 (1975). Később megfigyelték azonban, hogy bizonyos körülmények között, nevezetesen nagy sókoncentrációk esetén a VIII. faktor aktivitása elválasztható ettől a fehérjétől, amelyet felelősnek véltek a VIII. faktor aktivitásáért [Thelin és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 95, 70 (1961); Griggs és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 70, 2814 (1973); Donáti és munkatársai, Thromb. Rés., 2, 97 (1973); Weiss és munkatársai, Br. J. Haematol., 18, 89 (1970); Weiss és munkatársai, Thromb. Diath. Haemorrh., 27, 212 (1972); Weiss és munkatársai, Science, 182, 1149 (1973); Rick és munkatársai, Blood, 42, 737 (1973); Rick és munkatársai, Thromb. Rés., 7, 909 (1975); Thelin és munkatársai, Arch. Biochem. Biophys., 95, 70 (1961); Owen és munkatársai, Thromb. Diath. Haemorrh., 27, 502 (1972); Cooper és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 70, 2326 (1973)]. Ilyen körülmények között az alvadást aktiváló VIII. faktor 100.000 és 300.000 közötti molekulatömeget mutat. Azóta nagy erőfeszítések történtek a VIII. faktor véralvadást elősegítő hatásáért felelős fehérje/fehérjék azonosítására és jellemzésére. Ezeket a vizsgálatokat azonban akadályozta az, hogy a teljes vérben ez a fehérje csak nyomnyi 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
