202271. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vegetatív mikrobasejtek tartós tenyészetének előállítására
1 HU 202271 B A találmány tárgya új eljárás vegetatív mikróbasejtek ÍO^IO12, előnyösen 107-10u sejt/cm3 koncentrációjú tartós tenyészetének előállítására, amely +5 és +25 °C közötti hőmérsékleten 40 napnál hosszabb ideig eltartható aktív állapotban. Ismeretes, hogy a mikrobák vegetatív sejtjei megfelelő összetételű tápkózegben aktívan szaporodnak, majd a szaporodási sebesség csökken, végül a szaporodás megáll. Ezt követően a környezeti tényezők, például a tápanyagkomponensek arányainak megváltozása, az anyagcseretermékek felhalmozódása stb. hatására a sejtek előbb reverzibilisen, később irreverzibilisen károsodnak, aktivitásuk csökken, majd bekövetkezik az autolizis, melynek során a sejtek enzimjei a sejtállományt lebontják, és igy a sejtek elpusztulnak. Mikróbasejtek eltarthatóságának növelésére számos eljárást dolgoztak ki aszerint, hogy a tárolás rövidebb vagy hosszabb időt igényel, és milyen céllal (törzsfenntartás, ipari felhasználás stb.) történik. A gyakorlatban is alkalmazott eljárások hőelvonással (hűtés, fagyasztva tárolás, mélyhőmérsékletű tárolás folyékony nitrogénben) vagy vízelvonással (fagyasztva szárítás, alacsony hőmérsékletű vákuumszáritás, fluidizációs szárítás) igyekeznek az autolizist leállítani vagy sebességét csökkenteni. A mikróbák viselkedése hő- és vízelvonással szemben igen különböző, és nagy mértékben függ a sejtek előéletétől (szaporodási körülményeitől), a tenyészet korától, fiziológiás állapotától vagy attól, hogy a mikroba spóraképző-e vagy sem. A tartósítási eljárások kivitelezésénél e tényezők együttes hatása jelentkezik és befolyásolja az eredményt. [Packer E.L. et al. (1965) J. BacterioL 89, 718-724. p.]. Ennek tulajdonítható az a sok, egymásnak ellentmondó közlés, nem reprodukálható eredmény, amely a mikróbák tartós tenyészeteinek előállításával foglalkozó, igen kiterjedt szakirodalomban található [Hill L.R. (1981) Essays in Appl. Microbiol. Ed. Norris J.R. and M.H. Richmond, John Wiley and Sons Ltd.]. ' A modern biotechnológiai iparok a fermentációs folyamatokhoz nagy mennyiségben igényelnek nagy aktivitású oltókultúrákat. Ezeket az oltókultúrákat az erre a célra létesített laboratóriumokban és üzemekben állítják elő és bocsátják a felhasználók rendelkezésére. Az igények kielégítésére a legalkalmasabbak a vegetatív sejttenyészetek, amelyek közvetlenül használhatók fel a fermentációs folyamatok megindításához. A vegetatív sejttenyészetek azonban a hűtőtárolás körülményei között nem tarthatók el biztonsággal 1-2 hétnél tovább anélkül, hogy számottevő sejtpusztulással és aktivitáscsökkenéssel ne kellene számolni. Ez a károsodási folyamat nagyobb hőmérsékleten gyorsabban megy végbe [Strange R.E. et al. (1961) J. Gen Microbiol. 25. 61-67. p.]. A szakirodalomban az eltarthatóság mértékéül a sejtek túlélésére vonatkozó adatokat szokták megadni, holott legalább ennyire fontos a sejtek aktivitásának (enzimaktivitásának) alakulása a tárolás Borán, mely utóbbival kapcsolatban csak igen elvétve találhatók adatok a szakirodalomban. (Heckly R.J. (1978) Adv. in Appl. Microbiol. 24. 1-53. p.J. Az ismert nehézségek okozzák, hogy tartós tenyészetként a jelenlegi gyakorlatban általában fagyasztva szárított (liofilezett) vagy szárított tenyészeteket állítanak elő (Muggleton P.W. (1963) Prog. Indust. Microbiol. 4. 191-214. p.]. Ezeknek a készítményeknek a felhasználása azzal a hátránnyal jár, hogy a száraz sejteket előbb rehidratálni, majd tápanyagba oltva aktiválni kell, és csak ezt követően lehet a tenyészetet oltókultúraként a fermentáció megindításához felhasználni. Ilyen esetekben szemben a vegetatív sejttenyészetek alkalmazásával, ahol a tenyészet közvetlenül felhasználható - a fermentációs üzemeknek a szükséges rehidratálási és aktiválási műveletek elvégzésére is be kell rendezkedniük [Annear D.I. (1964) Aust. J. Exp. Bioi. Med. Sei. 42. 717-722. p.J, ami külön technológiai időt is igényel. A találmány célja, hogy olyan eljárást biztosítson, amellyel egyszerű módon lehet előállítani a tárolás és a szállítás körülményei között, mintegy +5 és +25 °C közötti hőmérsékleten legalább 40 napig megbízhatóan eltartható vegetatív mikróbasejt-tenyészetet, amelyben a tárolás során a lehető legcsekélyebb sejtpusztulás következik be, és amelynek biológiai aktivitása a lehető legnagyobb mértékben megmarad. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a fenti célt elérhetjük, ha a mikróbatenyésztéshez inokulumként használt vegetatív mikróbaszuszpenziót előzetesen káliumionokat tartalmazó neutrális sóoldattal kezeljük hűtés közben, majd a káliumionok kimosása után a sejttömeghez ionaktiv (liofil) makromolekulákat adagolunk, és az így kapott inokulum élszaporításával végezzük a tenyésztést. E felismerés alapján a találmány szerint oly módon állítjuk elő vegetatív mikróbasejtek 10®-1012, előnyösen 107-10u sejt/cm3 koncentrációjú tartós tenyészeteit, hogy egy vagy több mikróbatórzs vegetatív sejtjeinek szuszpenzióját sejtszám/cm3.10*7 mekv./liter káliumot tartalmazó neutrális vizoldható káliumvegyülettel kezeljük 5-15 °C hőmérsékleten 12-24 óra hosszat, azután a káliumvegyületet kimossuk, a szuszpenzióhoz annak tömegére számítva 0,1-50% előnyösen 0,2-40% 10-1000 um, előnyösen 20-500 pm szemcsenagyságú ionaktív atoxikus makromolekulás anyagot, előnyösen poliszacharidokat, fehérjéket, glikol-poiimereket, kovasav-vegyületeket vagy ilyeneket tartalmazó természetes vagy szintetikus anyagokat adunk, és az igy kapott inokulumot tápközegre oltva a sejte-2 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
