202271. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vegetatív mikrobasejtek tartós tenyészetének előállítására
3 HU 202271 B 4 két ismert módon legfeljebb két nagyságrend sejttömeg-növekedésig elszaporitjuk, majd kívánt esetben a kapott tenyészetet fizikai úton, előnyösen centrifugálással besűrítjük és/vagy különböző mikróbatörzsek több ily módon előállított tenyészetét összekeverjük. A tartós mikróbatenyészetet előnyösen úgy készítjük a találmány Bzerint, hogy a szaporítás céljára szolgáló, fiziológiás konyhasó oldatba felvett mikróbaszuszpenzióhoz káliumot adagolunk neutrális vizoldható só alakjában az alábbi összefüggés szerinti mennyiségben: milliekvivalens kálium literenként=sejtszám/cm3.10‘7. E célra előnyösen kálium-klorid, kálium-szulfát vagy kálium-dihidrogénfoszfát oldatát használjuk, de használhatjuk bármely más semleges káliumvegyület vizes oldatát, amely káliumvegyület biológiai szempontból elfogadható, oxidativ hatástól mentes aniont tartalmaz. Ezután a mikróbaszuszpenziót +5 és +15 °C közötti hőmérsékletre hűtjük le, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 12-24 órán át. Ekkor a sejttőmeget például centrifugálással elválasztjuk az oldattól, majd fiziológiás konyhasó oldattal célszerűen legalább kétszer mossuk és centrifugáljuk. A mosott sejttömeget fiziológiás konyhasóoldatban szuszpendáljuk, és a szuszpenzióhoz 0,1-50, előnyösen 0,2-40 tőmegX 10-1000, előnyösen 20-500 pm szemcseméretű ionaktiv atoxikus makromolekulás anyagot adagolunk. Ionaktiv atoxikus makromolekulás anyagként alkalmazhatunk szervetlen anyagokat, például természetes vagy mesterséges zeolitokat, természetes eredetű szerves anyagokat, például keményítőt, dextránokat, fehérjéket, alginátokat vagy ilyeneket tartalmazó növényi vagy állati eredetű természetes anyagok őrleményeit. Ezek az anyagok egyúttal a szubsztrátum molekulák hordozói is lehetnek. Használhatunk azonban ilyen adalékként szintetikus anyagokat is, különféle polimer molekulákat, igy például polietilénglikolt. Az ily módon elkészített inokulummal beoltjuk a mikrobák szaporítására alkalmas tápközeget, és a szaporítást a szokásos módon elvégezzük. A szaporítás körülményeit a mikroorganizmus természete határozza meg. Arra azonban ügyelnünk kell, hogy a szaporítást legfeljebb addig végezzük, amig a sejttömeg nem haladja meg az inokulumként használt sejttömeg százszorosát, vagyis a szaporítással legfeljebb két nagyságrenddel növelhetjük a sejtek számát, ha kielégítően tartós tenyészetet akarunk előállítani. A szaporítással kapott sejttömeg koncentrációját kívánt esetben például centrifugálással vagy más fizikai művelettel megnövelhetjük. Kívánt esetben eljárhatunk úgy is, hogy a besűrítés előtt vagy után összekeverjük több törzs elszaporitással kapott tenyészetét. Az igy kapott termék ÍO^IO13 sejt/cm3 mennyiségben tartalmaz sejteket, és 40 napig 4 vagy annál hosszabb ideig tárolható +5 és +25 °C közötti hőmérsékleten. A tárolás után mind élőcsiraszámát, mind aktivitását tekintve megfelel a felhasználási követelményeknek, és azonnal felhasználható fermentációs célokra. A találmány előnye, hogy lehetővé teszi vegetativ mikróbasejtek jól tárolható aktiv tenyészetének egyszerű módon való előállítását. A találmány szerinti eljárással folyékony vagy szilárd (géles állapotú), homogén és inhomogén tenyészet, továbbá baktériumok és gombák vegetatív sejttenyészete egyaránt előállítható. A találmány révén lehetővé válik ipari célú mikróbatenyészeteknek a felhasználás helyétől, idejétől és ütemétől független előállítása. A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük. 1. példa Lactobacillus brevis tartós tenyészetének előállítása Az inokulum készítése Fiziológiás konyhasó oldatban Lactobacillus brevis vegetatív sejtjeit szuszpendáljuk. A szuszpenzió csiraszáma 4.109 sejt/cm3. A szuszpenzióhoz 4.10sxl0'7=400 milliekvivalens káliumnak megfelelő 29,7 g/liter kálium-kloridot adagolunk. A szuszpenziót ezután lehűtjük +10 °C-ra, és 12 órán át állni hagyjuk. Ezt követően a mikróbaszuszpenziót 8000 g-n centrifugáljuk, és az üledéket fiziológiás konyhasó oldatban felvéve mossuk, centrifugáljuk és ezt a műveletet megismételjük. Mosás után a mikróbatömeget fiziológiás konyhasó oldatba vesszük fel, és beállítjuk a szuszpenzió eredeti (4.108 sejt/cm3) csiraszámát. Ezután a szuszpenzióhoz 25 tömegszázalék BL 55-ös lisztet adagolunk, és a szuszpenzióban keveréssel homogenizáljuk. A tartós tenyészet előállítása 100 liter alábbi összetételű tápoldatot készítünk: tripkazin 5 g, cellamin 3 g, glükóz 10 g, nátrium-acetát 5 g, kálium-dihidrogénfoszfát 1,5 g, magnézium-szulfát 0,06 g és desztillált víz 1 literre. A tápkózeg pH-ja 7,0. A 100 liter tápoldatot beoltjuk 1 liter előbbiek szerint készített inokulummal, és a szaporítást 38 °C-on anaerob eljárással a maximális csiraszám eléréséig végezzük. Az elért maximális csíraszám 3.10s sejt/cm3. A kapott sejtszuBZ- penziót centrifugálással 3.1010 sejt/cm3 csirakoncentrációra sűrítjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
