202259. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló szilárd táptalaj előállítására
1 HU 202259 B 2 A találmány az orvostudomány és a biológia területére vonatkozik és tárgya: eljárás különböző fajtájú mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló, szintetikus gél alapú, szilárd táptalaj előállítására. A 977466 sz. szovjet szerzői tanúsítványban leírtak alapján ismert olyan eljárás az orvosi és mikrobiológiai célokat szolgáló szilárd táptalaj előállítására, amelynél fiziológiás oldatban, gyökös kopolimerizációval (0,5-4,0):(2,5-12,0) tömegarány határok között akrilsavamidot és N,N’-metilén-bisz-akrilsavamidot reagáltatnak poliakrilsav-amid gél képződéséig. A kapott gélt, amely maximális mennyiségű vizet tartalmaz, fiziológiás oldattal öblíltik és tápoldattal impregnálják. Az így előállított szilárd táptalajt a mikroorganizmusok biológiai tulajdonságainak kutatására használják. Hátránya azonban az ilyen szilárd táptalajnak, hogy felületi rétegük sterilizáláskor, a mikroorganizmusok ráoltásakor, valamint a kolóniák oltókaccsal történő leválasztásakor nagyon sérülékeny. További hátrány, hogy ismételt ámításokkor - a fentiek miatt - a mikroorganizmusok leválasztása fiziológiás oldattal történő öblítéssel valósítható meg, ami viszont a legtöbb mikrobiológiai munkánál nem alkalmazható. A 3430316 sz. NSZK-beli közrebocsátási iratban olyan eljárást ismertetnek a mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló szilárd táptalaj előállítására, amelynél fiziológiás oldatban, gyökös kopolimerizációval (15—20):(0,019—0,132) tömegarány határok között akrilsavamidot és N,N’-metilén-bisz-akrilsavamidot reagáltatnak poliakrilsavamid gél képződéséig. A kapott gélt fiziológiás oldattal öblítik és 12-20 órán keresztül 50-60 °C hőméréskletű fiziológiás oldatban duzzasztják. Ezután a poliakrilsavamid gélt tápoldattal impregnálják. Az így előállított szilárd táptalajt mikroorganizmusok tenyésztésére használják. Előnye, hogy rugalmas, átlátszó és jó a felületi adhéziója. A mikroorganizmus tenyészetek a felületén helyezkednek el, anélkül, hogy a belsejébe hatolnának. A tenyészeteket oltókaccsal teljesen le lehet választani róla. Hátránya az ilyen szilárd táptalajnak, hogy a petri-csészében való tárolás és az inkubáció ideje alatt folyadék-kiizzadás tapasztalható a felületén, és ez az izzadmány termosztátban történő hosszabb szárítással sem szüntethető meg. További hátránya, hogy néhány mikroorganizmus fajta (különösen a mozgékony fonnák) nem képez az ilyen táptalajon jellemző morfológiai, biokémiai és antigén tulajdonságokkal rendelkező tipikus kolóniát. Ez a tény behatárolja - például a fertőző megbetegedések diagnosztizálásánál - a fentiekben leírt táptalaj felhasználását. A találmány célja olyan szilárd táptalaj előállítása, amely ezekkel a tipikus biológiai tulajdonságokkal rendelkező mikroorganizmusok széles spektrumának tenyésztését is lehetővé teszi. Ezt a célt a gél szerkezetének stabilizálásával érjük el. A gélrendszerek, közismerten nagy nedvességtartalmúak és eléggé labilisak. Az előállítás során beállt polimer-folyékony fázis egyensúly különböző tényezők hatására, például a hőmérséklet és a nedvesség hatása felborulhat. Ezért szükséges a keletkező gélt az előállítás során szerkezetileg stabilizálni. Felismertük, hogy ha az akrilsavamid és N,N’-metilén-biszakrilsav-amid polimerizációjánál poli(vinil-alkohol)-t adunk a reakcióelegyhez a jobb tömegeloszlás biztosítására például vizes oldat fotmájában, akkor a kopolimerizációnál és a gélképződésnél áthatolható polimerháló keletkezik, így a gél stabilizálódik, de a hidrofil jellege megmarad, ami nagyon fontos. A találmány tárgya tehát olyan eljárás a mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló szilárd táptalaj előállításra, amelynél fiziológiás oldatban gyökös kopolimerizációval (15—20):(0,019—0,132) tömegarányhatárok között akrilsavamidot és N,N’-metilén-biszakrilsavamidot reagáltatunk poliakrilsavamid gél képződéséig, ezt a gélt öblítjük, fiziológiás oldatban duzzasztjuk és tápoldattal impregnáljuk. A találmány értelmében a polimerizációt poli(vinil-alkohol) jelenlétében hajtjuk végre és a reakciónál az akrilsavamid és a poli(vinil-alkohol) kiindulási tömegaránya (15- 20):(1,0-3,0) határok közöttire állítjuk be. A poli(vinil-alkohol)-t vizes oldatban alkalmazhatjuk. A találmány legyelőnyösebb megvalósítási formájánál első lépésként 0,8-0,9 tömeg% nátrium-kloridot tartalmazó fiziológiás oldat felhasználásával elkészítjük az akrilsavamid és N,N’- metilén-bisz-akrilsavamid, az aktiváltorok és a poli(vinil- alkohol) szükséges oldatát. Aktivátorként N,N’-tetrametil-etilén- diamint és ammónium-peroxo-diszulfátot alkalmazunk. Az oldatokból olyan reakcióelegyet készítünk, amelyben az akrilsavamid, az N,N’-metilén-bisz-akrilsavamid és a poli(vinil-alkohol) tömegaránya (15- 20):(0,019—0,132):( 1,0—3,0) határok között van. A reakcióelegyet reaktorba öntjük, ahol lezajlik a gyökös kopolimerizáció a poliakrilsavamid gél pelyhek képződéséig. A poli(vinil-alkohol) mennyiségét a táptalaj polimer alapjának időbeli stabilitása és az adott alappal készített táptalajon tenyésző mozgékony mikroorganizmus fajták jellemző kolóniaképzésének megtartása határozza meg. A megadottnál kevesebb poli(vinilalkohol) alkalmazásával a polimer alap kellő stabilitását nem érjük el. Ha a megadottnál több poli(vinilalkohol)-t adunk a reakcióelegybe, akkor a polimer alap elveszti átlátszóságát, és ez nem kívánatos. Tehát ha a reakcióelegybe 1 g-nál kevesebb poli(vinil-alkohol)-t adunk, akkor nem stabilizálja a polimer alapot, így a termosztátban 37 °C hőmérsékleten történő inkubáció ideje alatt az alap felületén folyadék izzadmány megjelenését tapasztalhatjuk, így a mozgékony mikroorganizmus fajták tipikus kolónia-tenyészete az egyéb tulajdonságok megtartása mellett nem valósítható meg. Ha a poli(vinil-alkohol) mennyisége a reakcióelegyben meghaladja a 3 g-ot, akkor a stabilizáló hatást úgy fejti ki, hogy a polimer alap a kívánatosnál nagyobb sűrűségű lesz. Az ilyen polimer alap felhasználásával készített szilárd táptalaj felülete nagyon száraz, és a kaccsal történő oltásnál megsérül. Az ilyen táptalajon tenyésztő mikroorganizmusok a tipikustól eltérő fejlődést mutatnak, a táptalaj felületéről nehezen távolíthatók el. A kopolimerizációval kapott gélből állítjuk elő a szilárd táptalajt. A gél pelyheket fiziológiás oldattal öblítjük és a tömegük 3,5-5,0-szörös növekedéséig duzzasztjuk. A duzzasztás biztosítja a táptalaj rugalmasságát és az agarizált táptalajokhoz közeli sűrűségét. Az előzőekben leírtak szerint kezelt poliakril-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
