202254. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklodextrinek elválasztására
1 HU 202254 B 2 mivel a tennék sárgulását okozza (pl. 4.384.898 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalom);- nem szennyezettek egymással, mint pl. az alfa-CD erősen szennyezett béta-CD-vel a 3.640847 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerinti eljárás esetében. Eljárásunk részleteit az alábbi példákban mutatjuk be, a találmány korlátozásának szándéka nélkül. 1. példa 170 g kukoricakeményítőt felszuszpendálunk 340 g csapvízben, a kapott zagy pH-ját 10 tömeg %-os sósavval 5-6 közé, majd 10 súly % kálcium-hidroxid szuszpenzióval 7,1-7,4 közé állítjuk be. Ezután keményítő grammonként számított 2 SKB egység alfa-amiláz [NOVO Industri A.S. (Kopenhága)BAN-240 L típusú) hozzáadásával 80 °C-on, 15 percig elfolyósítjuk. A maradék amilolitikus aktivitást 120 °C-on 30 percig inaktiváljuk. Az így kapott hidrolizátum redukáló képessége 7,4 DE. (DE-dextrózekvivalens redukáló képeség, tömeg % szárazanyagtartalomban kifejezve). Ä hidrolizátumhoz 6H intervallumban 40 °C-on 4000 KE Bascillus speciens BM 10-68 (MNG0154 törzs) eredetű CGT enzimet adunk, majd 30 perc múlva 15 g metil-etil-ketonban (Reanal alt. minőség) oldott 15 g alfa-naftanollal (Reachim pure) egészítjük ki a reakcióé legyet. A kevertetést, az enzimes konverziót keverék formában 70 órán át folytatva kapjuk a 0,9% alfa-ciklodextrin, 13,4% béta-ciklodextrin ill. 6,81% gamma-ciklodextrin tartalmú konverzióelegyet (194939 lajstromszámú magyar szabadalom). A konverzióelegyet szobahőmérsékleten szűrjük, a csapadékot megszárítjuk, a szárított csapadék súlya 110 g, összetétele 51% béta-ciklodextrin, 23,3% gammaciklodextrin és 0,2% alfa-ciklodextrin. Ezután extrakciós szivattyúban a kiszűrt, szárított csapadékot 300 ml metanollal két óráig refluxáljuk, szűrjük a csapadékot, 40 ml meleg metanollal mossuk, majd felszuszpendáljuk. A kapott nyers ciklodextrint 300 ml metanolban Soxhlet extraktorban 2 óráig refluxáljuk, majd ezt követően a kiextrahált anyagot vákuum-szűrőn 100 ml metanollá mossuk. (A metanolos extrakció ismert a 60-120998 számú japán közrebocsátási iratból). A metanol-nedves csapadékot 400 ml metanolban felszuszpendáljuk, 200 ml desztillált vizet adunk hozzá és 2 óráig a gamma-ciklodextrin tartalmat kiextraháljuk. Az extraktlevet leszűrjük, a lepényt 200 ml 66%-os metanollal átmossuk, és az egyesített szűrlet és mosólevet a naftolnyomok eltávolítására sorbakötött 50 ml hidrogén-ion-ciklusú erős kationcserélőn és 50 ml hidroxi-ion- ciklusú erős anioncserélőn (Varion-KS és Varion-AD típus, Fűzfői Nitrokémia), engedjük át 1 ml/min sebességgel. Az ioncserélőről lejövő 1,5 liter effluens összetétele HPLC-vel detektálva: 0,2% alfa-ciklodextrin 0,71% béta-ciklodextrin 1,62% gamma-ciklodextrin 2. példa Az 1. példa szerint előállított ioncserélt effluens alfaciklodextrin tartalmát a béta- és gamma-ciklodextrintől úgy választjuk el, hogy az effluenst atmoszférikus nyomáson bepároljuk 100 ml-re, és 15 tf %-15 ml kloroformmal szobahőmérsékleten 2 órán át tartó erős kevertetéssel kicsapjuk a béta- és gamma-ciklodextrin kloroformkomplexét. A zömmel alfa-ciklodextrint és dextrineket tartalmazó anyalúgot szűréssel választjuk el, 30 ml-re bekoncentráljuk és az alfaciklodextrint 3 ml n-dekanolal kevertetve komplexáljuk. (Az n-dekanolos kinyerés ismert a 3 640 847 számú Amerikai Egyesült Államok-beli leírásból). A komplexeket kiszűrjük, és 20 ml desztillált vízben felszuszpendálva vízgőz-desztilláljuk, amíg a párlat szagtalan nem lesz. Ezután az oldatot 50% reflaktometriás szárazanyagtartalomig bekoncentráljuk és hűtőszekrényben egy éjjelen át az alfa-ciklodextrint kristályosítjuk. Szűrés és szárítás után 2,3 g 99,6% tisztaságú alfa-ciklodextrint kapunk. 3. példa A 2. példában nyert szilárd béta- és gamma-ciklodextrin kloroformkoplexet egy laboratóriumi üvegbepárló készülékben (Rotadest-M), 200 ml desztillált vízben felszuszpendálva a komplexet megbontjuk és a kloroformtartalmat kb. 100 ml párlat szedésével lepároljuk. Az üstmaradék szárazanyagtartalmát desztillált víz hozzáadásával 15 tf%-ra beállítjuk, háromszor 50 ml-es aliquot részre bontjuk, majd hozzáadunk 3 tf % ciklohexánt. Az elegyet homogenizátorban (Biomix, Labor MIM gyártmány) 1/2 óráig erőteljesen rázzuk, majd a keletkezett oldhatatlan oldószerkomplexet szűréssel eltávolítjuk. HPLC eljárással mérjük a csapadék és az anyalúg ciklodextrin tartalmát. Ciklohexán (tf %) béta-CD (%) gamma-CD (%) szilárd folyadék szilárd folyadék fázisban fázisban 1 3,9 0,74 0 11,0 3 83,2 0 0 11,0 6 71,4 0 13,1 10,4 4. példa A 3. példában nyert 16 ml kloroform-mentes koncentrátumot 5 ml ciklohexánnal egy homogenizátorban (Biomix típus, Labor MIM gyártmány) 10 percig homogenizáljuk, majd a kivált csapadékot kiszűrjük, 50 ml desztillált vízben felszuszpendáljuk, újra szűrjük, 100 ml desztillált vízben felszuszpendáljuk, Rotadest M készüléken, atmoszférikus nyomáson, 70% szárazanyagtartalomig bekoncentráljuk. Egy éjszakán át +4 °C-on kristályosítjuk. A leszűrt és szárított béta-ciklodextrin súlya 98 g, tisztasága HPLC módszerrel meghatározva 99,8%. 5. példa A ciklohexános komplexképzés után leszűrt anyalúg CD-tartalmát HPLC módszerrel meghatároztuk:- alfa-CD-0,05%- béta-CD-0,23% - gamma-CD-11,2% Atmoszférikus nyomáson, Rotadest készülékben bepároltuk 50% szárazanyagtartalomig, +4 °C-on egy éjszakán át kristályosítottuk. Szűrés, szárítás után 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
