202250. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 202250 B 2 rációja a QAE gyantáról történő leoldáshoz. A találmány szerinti eljárás ioncserélő módszerében tehát nagyon fontos, hogy az alkalmazott ioncserélő gyantát és a megfelelő eluáló sókoncentrációt helyesen határozzuk meg. így például poli-I esetén a DEAE gyanta különösen jó eredményeket adott. Poli-C esetén úgy találtuk, hogy mind a QAE, mind a DEAE gyanta előnyös eredményeket ad. Eluálásra akár lineárisan emelkedő sókoncentrációt, akár lépcsőzetesen emelkedő sókoncentrációt alkalmazhatunk, ezáltal a polimereket frakcionálhatjuk és eluálhatjuk a polimerek lánchosszának megfelelően. így például, poli-C-t (38 mg, S20, 8,6) adszorbeáltunk DEAE-Toyopearl 650 C gyantán (10x130 mm), és a következő (A) és (B) oldat 100-100 ml-ével lineáris gradiens eluciót végeztünk: (A) - 0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCL (pH«7,0) (B) - 0,5 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0) A (B) oldatra nézve a lineáris gradiens 0-100% volt. Az eluálás körülményei a következők voltak: lineáris átfolyási sebesség: 1,32 ml/perc, eluálási térfogat: 175 csepp/frakció. A következő frakciókat eluáltuk, az egyes lánchosszaknak megfelelően: Frakció bázisszám 33 340 34 470 35 740 36 1000 37 1500 Emellett ugyanezt a mintát eluáltuk lépcsőzetes gradiens eluálással, amikoris az 500 bp alatti frakciót eluáltuk először 0,3 mmól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0) (50 ml) segítségével, majd az 500-1500 bp frakciókat eluáltuk 0,5 mól/1 NAC1/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0) (50 ml) segítségével. Ugyanilyen módon poli-I-t (7,8 mg, S20, 7,3) eluáltunk lineáris gradiens elucióval ugyanilyen feltételek mellett. A következő frakciókat kaptuk: Frakció bázisszám 35 30 36 140 37 230 38 350 39 460 40 540 Emelett ugyanezt a mintát lépcsőzetes gradiens eluálással is eluáltuk, amikor is a 300 bp alatti frakciókat eluáltuk először 0,3 mól/1 NaCl/10 mmól/I tris-HCl (pH=7,0) (50 ml) segítségével, majd a 300- 600 bp frakciót eluáltuk 0,5 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0) (50 ml) segítségével. Ahogyan említettük, a nagymolekulájú nukleinsavak is frakcionálhatók a találmány szerinti módszer értelmében meghatározott lánchosszúságú nukleinsav frakciókra (méretmeghatározás), ha megfelelően választjuk meg az eluálószer sókoncentrációját. Amint a fenti két példa is mutatja, gyógyszerkészítmények céljára megfelelő lánchosszúságú frakciók (főkomponensként) könnyen nyerhetők különböző nagymolekulájú, eltérő lánchosszúságú nukleinsavak keverékéből frakcionálással, és a frakcionálás ipari elvégezhető. A találmány szerinti „ioncserélő” eljárás egy fontos szempontja a frakcionálás. A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav származékok fiziológiai aktivitása különösen előnyös a gyógyszekészítmények előállítása szempontjából. A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazékok erős karcinosztatikus aktivitást mutatnak, amelyet a következőkben részletezünk. Ez csak egyike a különböző fiziológia aktivitásoknak, amelyeket a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazékok mutatnak. A találmány szerinti eljárással előállított, poli-I.poli-C csoportot tartalmazó nukleinsavszármazékok további fiziológiai tulajdonságként megemlíthető még a TNF-interferon-, valamint interleukin-2-termelést fokozó képesség, makrofág-aktiváló képeség, NK sejt aktiváló képeség, tumor sejtek osztódását gátló aktivitás, tumor sejtek osztódását gátló aktivitás humán tumor sejteket hordozó meztelen egerekben, „made nice” tumor sejtek metasztázisát gátló aktivitás tüdőben, stb. A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazékok lényegesen biztonságosabbak, mint a szokásos poli-I.poli-C vegyületek, például az interferon-indukálószerek. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek alkalmasak antivirális antitumor, stb. hatóanyagként napi 10-1000 mg/személy dózisban. A találmány szerinti eljárással előállított nukleinsav származékok fiziológiai tulajdonságait a párhuzamos, 62-167 433 számú japán szabadalmi bejelentésben mutattuk be. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül. Példa (1) L-poli-I előállítása és tisztítása (méretezett poli-I) 200 ml desztillált vizet, 250 ml formamidot és 500 ml 5 mól/l-es nátrium-klorid oldatot hozzáadunk 10 g kereskedelmi poli-I-hez, és az oldatot 4 óra hosszat 80 °C-on hevítjük. A reakcióelegy aliquot részét, pl. 10 pl-t, amelyet a reakció kezdetétől számított 2 óra eltelte után, majd óránként veszünk, HPLC gélszűrésnek vetjük alá, TSK gél G-DNA-PE oszlopon (7,88x300 mm), eluálószert: 50 mmól/1 trisz-HCl puffer (pH=7,5), 0,3 mól/1 NaCl oldat, 2 mmól/1 EDTA, átfolyási sebesség: 0,5 ml/perc. A reakció pl. jeges hűtéssel leállítjuk, amikor egy 21,86±0,2 perc retenciós idejű frakció megjelenését észleljük. A reakcióelegyhez kétszeres térfogatú etanolt adunk, és a képződött csapadékot centrifugálással összegyűjtjük (3000 ford/perc, 4 °C). A kapott terméket 70%-os etanollal mossuk, vákuumban megszárítjuk, és így 10,2 g L-poli-T-t kapunk. Az eljárásban alkalmazott víz és oldatok sterilizált anyagok. Ugyanezt az eljárást alkalmazzuk a továbbiakban. (2) L-poli-C előállítása és tisztítása (méretezett poli-C) 200 ml desztillált vizet, 250 ml formamidot és 50 ml 5 móPl-es nátrium-klorid-oldatot hozzáadunk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
