202250. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 202250 B 2 10 g poli-C-hez, és 4 óra hosszat 80 °C-on melegítjük. A fent leírt HPLC gélszűréssel követjük a reakciót (végpont a 21,33±0,2 perc retenciós idejű frakció megjelenésekor). A rekacióelegyhez kétszeres térfogatú etanolt adunk, és a képződött csapadékot centrifugálással összegyűjtjük (300 ford/perc, 4 °C). A kapott terméket 70%-os etanollal mossuk, vákuumban megszárítjuk, és így 9,5 g L-poli-C-t kapunk. (3) L-poli-C kénezése 8.0 L-poli-C-t, amelyet az előző, (2) lépés szerint állítottunk elő, feloldunk 240 ml vízben és egy 500 ml-es acél reaktorba helkyezzük. Jeges hűtés közben hozzáadunk 12 g kénhidrogént tartalmazó 120 ml piridint. Lezárás után a reaktort 50 °C-on hevítjük 10 óra hosszat. Lehűtés után hozzáadunk 200 ml TE-vel telített fenolt, keverjük, majd 3000 ford/perc sebességgel, 15 °C-on 5 percig centrifugáljuk. Tizedrész 5 mól/-es nátrium-klorid-olatot és kétszeres mennyiségű etanolt adunk a vizes oldathoz, és a képződött csapadékot 3000 ford/perc sebességgel, 4 °C-on, 10 percig centrifugálva elválasztjuk, 70% etanollal mossuk, vákuumban megszárítjuk, így 8,0 g L-poli(C20, S4U)-t kapunk, azaz olyan méretezett poli-C-származékot, amelyben a citidilsavak egy részét 4-tiouridilsavval cseréltük ki olyan mennyiségben, hogy 20 citidilsavra egy 4-tiouridilsav jusson. Az említett TE jelentése: 10 mmól/l-es tris-HCl puffer (pH-7,5), amely 1 mmól/1 EDTA-t tartalmaz. (4) Temperálás 6.00 g a (3) lépés szerinti módon kapott L-poli(C20,S4U)-t és 6,44 g, az (1) lépés szerinti módon kapott poli-I-t feloldunk 300 ml 10 mmól/l-es tris-HCl pufferben (pH-7,5), amely 50 mmól/1 nátrium-kloridot tartalmaz, és jól elkeverjük. A kapott oldatot 70 °C-ra melegítjük vízfürdőn, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 10 percig. Ezután hagyjuk lehűlni, és egy éjszakán át állni. A temperált oldatra számítva fele térfogatú fenollal extraháljuk, a vizes fázist elválasztjuk, a temperált oldatra számítva kétszeres térfogatú etanolt adunk hozzá, a képződött csapadékot az eredeti temperált oldat kétharmadának megfelelő vízzel feloldjuk. Ezután a kapott oldatot 4 °C-on 100-szoros mennyiségű vízzel szemben dializáljuk. A dializáláshoz Spectrapor 2 membránt használunk (Spectrum Medical Industries, Inc., Los Angeles, USA gyártmány). A dialízis 2. napján a só eltávolítását egy elektromos vezetőképesség mérővel ellenőrizzük (CD-35MÜ modell, M and S Instruments Inc., Japán gyártmány). A dializátumot vákuumban 40 °C-on felére bepároljuk, majd fagyasztva szárítjuk, és így 12,4 g temperált, sómentes terméket kapunk. (5) Méretmeghatározás ioncserélő módszerrel Az ioncserét lineáris gradiens elucióval vagy lépésenkénti elucióval végezzük. Mindkét esetben azonos a kitermelés és a termék lánchossza, feltételezve, hogy az eluálás körülményeit alkalmasan választottuk meg. L-poli-C és L-poli(C,S4U) lépésenkénti eluálásához 0,15 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0) és 1,0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0) oldatokat használunk. L-poli-I lépésenkénti eluálás szempontjából az alábbi (5-1) példákra hivatkozunk. L-poli-I lineáris gradiens eluálására a következő (A) és (B) oldatot használjuk, és az eluálást a (B) oldat 0-tól 100%-ig változó gradiense mellett végezzük. (A) : 0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0), (B) : 0,5 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0). L-poli-C és L-poli(C,S4U) lineáris gradiens eluá-lása szempontjából az alábbi (5-2) és (5—4) példákra hivatkozunk. (5-1) L-poli-I méretmeghatározása 210 mg, az (1) lépés szerinti módon kapott L- poli-I-t feloldunk 5 ml 10 mmól/l-es tris-HCl pufferben (pH-7,0) és DEAE- ToyopearlRTM 650 C oszlopon (10 mm x 130 mm) adszorbeáljuk. Ezután 1,30 cm/perc lineáris átfolyási sebsség mellett lépésenkénti eluálást végzünk 50 ml 0,03 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0) és 80 ml 0,5 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH=7,0) oldattal. A 0,5 mól/1 NaCllel eluált frakciót összegyűjtjük, és retenciós időt ugyanolyan HPLC gélszűréssel mérjük, mint a fenti (1) lépésben, amely 21,90±0,2 percnek adódik. Az L-poli-I-t, amelynek bázisszáma 100-1000, 91%-os kitermeléssel kapjuk. (5-2) L-poli-C méretmeghatározása 610 mg, a (2) lépés szerinti módon kapott L-poli-C-t feloldunk 10 ml tris-HCl pufferben (pH=7,0), és QAE-ToyopearlRTM 550 C oszlopon (10 mm x 130 mm) adszorbeáljuk. Ezután lineáris gradiens eluálást végzünk 1,30 cm/perc átfolyási sebességgel, 100-100 ml (A) és (B) oldattal, ahol a (B) oldat 0-tól 100%-ig változik. (A) : 0,0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0), (B) : 1,0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0). A fő csúcsként előuált eluált frakciót összegyűjtjük, és a retenciós időt megmérjük HPLC gélszűréssel, amely 21,35±0,2 percnek adódik. Az L-poli-C-t, amelynek bázisszáma 100-1000, 93% kitermeléssel kapjuk. (5-3) L-poli(Cj2,U) méretmeghatározása 19 mg poli(Ci2U)-t (amelyben a citidilsav egy részét uridilsavra cseréltük olyan mennyiségben, hogy 12 citidilsavra egy uridilsav jusson), amelynek retenciós ideje az (1) lépés szerinti HPLC gélszűrés szerint 18,67 perc, feloldunk 5 ml tris- HCl pufferben (pH=7,0), és DEAE-ToyopearlRTM 650 C oszlopon (10 mm x 130 mm) adszorbeáljuk. Ezután ezt lineáris gradiens eluállással, 1,30 cm/perc átfolyási sebességgel eluáljuk, 100-100 ml alábbi (A) és (B) oldatot használva eluálószerként úgy, hogy a (B) oldat mennyisége 0-tól 100%-ig változik. (A) : 0,0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0), (B) : 0,5 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0). A főcsúcsnként eluált frakciókat öszegyűjtjük, és a retenciós időt HPLC gélszűréssel megmérjük, amely 18,97±0,2 percnek adódik. Az L-poli(Ci2,U)-t, amelynek bázisszáma 100-1000, 87% kitermeléssel kapjuk. (5-4) L-poli(C20,S4U) méretmeghatározása 600 mg, a (3) lépés szerinti módon kapott L-poli(C20,S4U)-t feloldunk 10 ml tris-HCl pufferben (pH-7,0), és QAE-ToyopearlRTM 550 C oszlopon (10 mm x 130 mm) adszorbeáljuk. Ezután lineáris gra5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
