202250. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 202250 B 2 összefüggésben van a (2) pont alatt említett szemponttal. A molekulatömeg elektroforézissel végzett szokásos meghatározási módszere szerint legalább egy teljes éjszaka szükséges a vándorláshoz, festődéshez és más lépésekhez. A találmány értelmében ezzel szemben HPLC gélszűrést végzünk a nukleinsav származékok molekulatömegének meghatározására, így a kívánt molekulaméret eloszlású (azaz a 4S és 13S ülepedési konstansú vagy 50-10 000 bázisszámú) származékok eluálása előtt szükséges idő jelentősen lerövidíthető. A találmány értelmében a reakciót leállítjuk, amikor azt észleljük, hogy a méretezési reakció végbement, és evégett egy rövidszénláncú alkoholt adunk a reakcióelegyhez. A rövidszénláncú alkoholok közül különösen az etanol előnyös. Az etanolos kicsapás után az poli-C-ből nyert L-poli-C (azaz méretezett poli-C: az „L” előtag a továbbiakban azt jelenti, hogy méretezett) kitermelése 93%, és poli-I-ből nyert L-poli-I kitermelése 78%. A méretezett termék kitermelése tehát magas. Az ismert módszereknél ezzel szemben a reakcióoldatot dializáló csőbe kell helyezni. Ebben az esetben a kitermelés csupán 60% körüli, és a poli-I-ből mindössze 40% körüli L-poli-I várható. Emellett a dialízishez körülbelül 3 nap szükséges. A találmány szerinti etanolos kicsapási módszer szeirint, etanolt adunk a reakcióoldathoz annak térfogatára számítva kétszeres mennyiségben, és addig keverjük, míg a kívánt termék ki nem csapódik, majd a kapott csapadékot centrifugáljuk, mossuk és megszárítjuk. Ez az eljárás egy órán belül befejezhető. A (3) pont alatt említett szempont a találmány szerinti eljárás egyik legfontosabb szempontja. Méretezett egyszálú nukleinsav polimerben levő nukleinsav- maradékban található nitrogénatom helyettesítése kénatommal (például poli-C-ben levő citidin-maradék aminocsoportjának merkaptocsoporttal történő részleges szubsztitúciója) úgy, hogy az illető nukleinsav-maradékot más nukleinsavvá alakítsuk (amely reakciót a továbbiakban kénezésként említünk), kopolimerek szintézisénél gyakran hasznosított reakció. A találmány szerinti eljárás egy' másik jellemzője az, hogy a kénezett kopolimerek izolálása végett aril-alkoholt adunk a méretezett egyszálú nukleinsav polimerekhez. Ez a fent említett (4) szempont. Aril-alkoholként például fenolt vagy krezolt alkalmazhatunk. Például úgy járunk el, hogy fele mennyiségű fenolt adunk a piridint, vizet és kénhidrogént tartalmazó rekacióelegyhez, keverjük, centrifugáljuk, így a vizes fázis elválik a fenolos rétegtől, és a reakcióelegyben levő színező anyag, valamint a melléktermékként képződött kén a fenolos fázisba kerül. Ezután a vizes fázist elválasztjuk, és a kívánt terméket vizes sóoldattal és alkohollal kicsapjuk. Ezután az így kicsapott terméket centrifugálással elválasztjuk, majd alkohollal mossuk, és így a tisztított terméket kapjuk. Az említett eljárással a kénhidrogén majdnem teljes mennyisége a felülúszóba kerül kénhidrogénoldat formájában, és így könnyen eltávolítható a rekacióterméktől. A találmány értelmében fenolt alkalmazva a művelet egy órán belül, majdnem 100% kitermeléssel elvégezhető. Emellett a termék kvantitatíve izolálható. A fenti (2) - (4) szempontok fontosak a temperálás előtti méretezés céljából. Nevezetesen ezek különösen fontosak ahhoz, hogy a méretezési műveletet a temperálás előtt hatékonyan elvégezzük. A fenti (5) szempont a találmány szerinti eljárás egy további fontos jellemzője, amely szerint a méretezés és a temperálás között méretmeghatározást hajtunk végre. Ezt az alábbiakban részlegezzük. Ebben a lépésben egy ioncserélő gyantát alkalmazunk. Nagymolekulája nukelinsavakhoz ioncserélő gyantaként például DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex, benzoilezett DEAE-Cellulose vagy hasonló a t- RNS-hez is alkalmazott gyanták használhatók. (BBA, 47, 193, 1961; BBRC, 10, 200, 1963; Biochem. 6, 3043,1967). Gyakorlatilag azonban ioncserélő gyantát csak kismolekulájú, körülbelül 80 bázist tartalmazó nukleinsavak tisztítására alkalmaznak. Kutatásokat folytattunk arra vonatkozóan, hogy az ioncserélő gyanták tekintettel „töltés-adszorbeálló” tulajdonságukra megfelelőek-e nagymolekulájú nukleinsav polimerek tisztítására és a bázisszám alapján történő elválasztására. Tekintettel arra, hogy a termékek különösen előnyösek gyógyszerkészítmények hatóanyagaiként, különösen fontos a molekulaméretek pontos behatárolása ioncserélő gyanták segítségével. (Az eljárást a továbbiakban „ioncserélő módszer”ként említjük). A találmány szerinti ioncserélő módszerben az ioncserélő gyantát egy, a kezelendő gyantát tartalmazó tárolóedénybe helyezzük (szakszos eljárás), vagy eljárhatunk úgy is, hogy kromatografáló oszlop tölteteként alkalmazzuk (oszlop-eljárás). Közelebbről úgy járunk el, hogy az ioncserélő gyantát az oszlopba helyezzük, és a nukleinsav polimer oldatát az oszlopba juttatjuk úgy, hogy a polimer az ioncserélő gyantán adszorbeálódjon. Ezután egy eluálószert, például tríspuffert engedjük át az oszlopon folyamatosan vagy lépésenként, változó sókoncentrációval úgy, hogy egyenletes mennyiségű eluátumot kapjuk. Az eluált fraklciókban található nukleinsav polimer bázisszámát ugyanazzal a HPLC gélszűréssel határozzuk meg, jelzőként egy markert használva, és így azok a frakciók, amelyek a kívánt terméket tartalmazzák, összegyűjthetők. Annak érdekében, hogy a találmány szerinti eljárásban a fenti ioncserélő módszerrel a megfelelő terméket nyerjük, nagyon fontos, hogy az oszlopba töltendő ioncserélő gyantát és az eluálószert jól válasszuk meg. így például, ha poli-I-t tris-HCl pufferben oldunk, és QAE-n (kvatemer amino-etilén) adszorbeáljuk, a kívánt terméket nem tudjuk előállítani, még akkor sem, ha kölünösen magas sókoncentrációt alkalmazunk az eluálószerben. Ez azért van így, mert a poli-I maga oldahatatlanná válik, amikor a sókoncentráció az eluálószerben magasabb, mint az a koncentráció, ami megfelelő lenne poli-I leoldására a QAE gyanáról. Ez nyilvánvaló, ha figyelembe vesszük, hogy az inozinsav, amely a poli-I alkotóegysége, strukturálisan inkább hidrofób. Ebben az esetben a poli- I-hez megfelelő sókoncentráció a poli-C esetén alkalmas koncentrációval történő összehasonlítás alapján határozható meg. Egy másik kísérletben megfigyeltük, hogy a poli-I oldata fehérré és zavarossá válik, azaz csapadékot képez a pufferben, amelynek megfelelő a sókoncent5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
