202250. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 202250 B 2 adott méret pontosan megfelel- e egymásnak a nukleinsavak molekulatömegének jellemzése szempontjából. Ennek megfelelően a találmány szerinti nukleinsav polimerek molekulatömegének megadására az S értékkel történő jellemzést is alkalmazzuk a leírásban, a nukleinsav-kémia területén szokásos módszereknek megfelelően. Mivel azonban az „S érték”-et a makromolekulás nukleinsavak molekulái össztömegének mérése útján határozzuk meg ez az egész molekula-tömegre (vagy az anyag molekuláris állapotára) vonatkozik, az anyag lánchosszának (amelyet bázisszámként jelölünk) mérete alapján történő jellemzést is megadjuk az említett „S értékkel” együtt. Ez különösen azért történik így, mivel a molekulatömeg-eloszlás határtékeit differenciáltabban kell megjeleníteni a jelen találmánnyal kapcsolatban. A poli-I.poli-C és ennek különböző, poli-I.poli-C egységeket tartalmazó származékai méretezésének módszere annak érdekében, hogy méretezett kettősszálú nukleinsavakat kapjanak, abban áll, hogy már meglevő kettősszálú nukleinsav polimereket kis molekulájú vegyületekké bontanak, vagy más módszer szerint egyszálú nukleinsavakat hidrolizálnak kismolekulájú vegyületekké a temperálás előtt. Ezek az ismert módszerek azonban kényelmetlenek a kívánt termék ipari méretekben történő előállítására, mivel a méretezés hosszú ideig tart, az eljárás nem gyorsítható. Emelett ezek módszerek nem mindig kielégítőek a termék kitermelése szempontjából. Másrészt, ha egyszálú nukleinsavpolimereket - méretezés után - kénezni kell, a polimereket hidrogén-szulfiddal kénezik, majd a hidrogén-szulfidot desztillációval eltávolítjuk az oldószerből, ismert módszerek szerint. így például piridines oldatban végzett kénezés után a hidrogén-szulfidot a reakcióelegyből úgy távolítják el, hogy vákuumbepárlással a kénhidrogént a piridinnel együtt eltávolítják. A hidrogénszulfid azonban ekként a levegőbe jut, így ez a módszer ipari méretekben környezetszennyezés miatt nem megfelelő. Emellett a piridin lepárlása után visszamaradó vizes fázist dializáló csőben ármaló vízzel szemben dializálják a termék kinyerése céljából. Az eljárás végrehajtásához legalább 3 napra van szükség, és a terméket legfeljebb 80% körüli kitermeléssel nyerik. A módszernek tehát számos hátránya van a termék kitermelése, az előállítási költségek és a végrehajtáshoz szükséges idő szempontjából. A technika állása szerinti méretezési módszerekkel kapcsolatban számos probléma adódik. Általánosan ismert módszer szerint [D.H. Hayes: „The Hydrolisys of Ribonucletci Acid with Aqueous Formaldehidé Journal of Chemical Society, (I960) 1184-1187 oldal] a nukleinsav polimereket formaldehid jelenlétében hevítve kismolekulásjú vegyületekké hidrolizálják. Ezen ismert módszer szerint kívánt lánchosszúságú terméket úgy állítanak elő, hogy a reakcióidőt és rekacióhőmérsékletet megfelelően szabályozzák, majd a reakcióelegyet dialízisnek vetik alá a túlságosan elbomlott, túl kis molekulásjú vegyületek eltávolítására. Az ismert módszerrel azonban különböző molekulatömegű vegyületeket kapnak a méretezéssel, még akkor is, ha a reakciókörülményeket azonosan tartják, az alkalmazott nukleinsav polimerektől függően. így a módszer nehezen reprodukálható. Ennek oka az, hogy a nyersanyagot enzimreakcióval állítják elő, és a nyersanyag mérete nem tartható állandó értéken. Emelett a módszerben alkalmazott dialízissel elméletileg lehetetlen a kívánt terméknél nagyobb lánchosszúságú nukleinsav polimereket eltávolítani. A fentiek alapján szükség van olyan módszerre, amely a fenti hátrányok kiküszöbölését lehetővé teszi. A találmány szerinti módszer lehetővé teszi, hogy (1) méretezett kettősszálú nukleinsav polimereket nyerjünk gyors eljárással; (2) nagy kitermeléssel dolgozzunk, (3) ipari méretekben se okozzunk környezetszennyezést és más zavarokat, (4) a műveletek sora kellőképpen kvantitatív eredményeket adjon és reprodukálható legyen. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás kettősláncú nukleinsavszármazékok előállítására RNS- ből, amelyben a molekulák méretének maximális eloszlása 50 és 10 000 bázis illetve 4S és 13S ülepedési konstans közé esik, amelynek során a nukleinsav polimereket a temperálás előtt méretezzük. A találmány lényege a következő: (1) az egyszálú nukleinsav polimereket temperálás előtt méretezzük. (2) az (1) lépésben a méretezésre HPLC-t (nagysebeségű folyadékkromatográfiás gélszűrés) végzünk a szokásos elektroforézis helyett, úgy, hogy a termék molekulaméret eloszlása számszerűen meghatározható legyen. Ennek megfelelően a molekulaméret eloszlás fluktuációja könnyen kiküszöbölhető úgy, hogy a kívánt, 4S és 13S ülepedési konstans (vagy 50 és 10 000 bázisszám) molekulaméret eloszlási határok közé eső termékek gyorsan megkaphatók. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi a termékek gyors és pontos elválasztását a lánchossz szerint. (3) méretezés után rövidszénláncú alkohol adagolásával elválasztjuk a terméket az oldatból (ismert módon a terméket dialízissel nyerjük). A találmány szerinti módszer lehetővé teszi a termék nagyon egyszerű módszerrel, magas kitermeléssel történő kinyerését. (4) méretezés után, ha a kapott egyszálú nukleinsav polimerek kénezésére van szükség, a polimereket először kénhidrogénnel kénezzük, majd a reakcióelegyhez aril-alkoholt adunk, és a kapott oldatból centrifugálással eltávolítjuk a terméket, így a kénhidrogén az oldatban marad. (Az ismert módszerekben a kénhidrogént közvetlenül desztillációval választják el az oldószertől). Ennek megfelelően a találmány szerinti módszerrel nagyon egyszerűen távolítható el a kénhidrogén a kitermelés növelése mellett. (5) a méretezett egyszálú nukleinsav polimerek molekulaméret eloszlásának ellenőrzésére és szűkítésére ioncserélő gyantát használunk. Temperáláson olyan módszert értünk, amelynek során komplementer egyszálú nukleinsav polimereket kettősszálú polimerekké kapcsolunk, ez a művelet könnyen elvégezhető. Ha a méretezést temperálás után végezzük, a kénezés mértéke nagyon ingadozó lesz, így nehéz a terméket kvantitatíven megkapni. Ezért megpróbáltuk a méretezést a temperálás előtt végezni. Az eredmény igen kiváló lett. A találmány lényegeként az (1) pontban említett szempont szoros 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
