202235. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lankacidin-származékok előállítására
11 HU 202 235 B 12 11. referenciapélda Észteráz-enzim előállítása 14-0-dezacilezéshez 40 liter térfogatú tartályba 5 liter Streptomyces rochei subsp. volubilis No. T-2636 (IFO12507, FERMP-6155) tenyészet szűrletet (részletes ismertetését lásd Toku Ko Sho 47-20959 Official Gazette) helyezünk, majd ehhez 20 liter 95%-os etanolt adunk. Az elegyet megfelelően kevertetjük, majd 12 órán át, 10 °C hőmérsékleten vagy ez alatti hőmérsékleten állni hagyjuk. A felülúszót szifon segítségével eltávolítjuk, és a maradék iszapot centrifugáljuk: (körülbelül 5-10 'C hőmérsékleten, 2000 x g vagy ennél több). Az így kapott anyagot 1 napon át 10 "C vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten (6,65 Pa vagy ennél kisebb nyomáson) vákuumban szárítjuk. Szürkésfehér enzimkészítményt kapunk. 12. referenciapélda Lankacidin C előállítása 102 mg lankacidin A-t feloldunk 20 ml metanolban. Az oldathoz 80 ml vizes oldatot adunk, ami 2 g, a 11. referenciapélda szerinti eljárással előállított enzimet tartalmaz. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 30 percen át kevertetjük, majd a metanolt desztillációval eltávolítjuk. A desztillációs maradékot izobutil-keton-tctrahidrofurán (1:1) elegyével extraháljuk, majd az extraktumot magnézium-szulfáton szárítjuk. Az oldószert desztillációval eltávolítjuk, majd a maradékhoz dictil-étert adunk. Fehér, porszerű kristályos anyag válik ki, amit kiszűrünk, szárítunk. 24,85 mg cím szerinti vegyületet kapunk. A kapott termék NMR- és IR-spektruma, valamint VRK kromatogramja megegyezett a fermentációs módszerrel előállított lankacidin C ugyanezen jellemzőivel. 13. referenciapélda Lankacidin C-8-acetát előállítása 109 mg lankacidin C-8,14-diacetátot feloldunk 20 ml metanol és 10 ml tetrahidrofurán elegyében. Az oldathoz 80 ml vizes oldatot, ami 2 g, a 11. referenciapélda szerinti eljárással előállított enzimet tartalmaz, adunk, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 50 percen át kevertetjük. A reakcióelcgyből a metanolt és a tetrahidrofuránt desztillációval eltávolítjuk, majd a desztillációs maradékot kloroform-aceton elegyével extraháljuk. A szerves réteget magnézium-szulfáton vízmentesítjük, majd az oldószert desztillációval eltávolítjuk. A desztillációs maradékot 60 g szilikagélt tartalmazó kromatográfiás oszlopon kromatografáljuk, eluálószerként etil-acetát-kloroform (2 : 1) elegyét alkalmazva. 8 g-os frakciókat gyűjtünk. A 25-36 frakciókat egyesítjük, az oldószert desztillációval eltávolítjuk. 42,2 mg cím szerinti vegyületet kapunk, fehér kristályos anyag formájában. NMR-spektrum (90 MHz, CDC13) 8: 1,28 (d, J = 7 Hz, 17-Me), 1,37 (s, 2-Me), 1,55 (s, 11-Me), 1,90 (s, 5-Me), 2,03 (s, OAc), 2,2-2,6 (m, 9-H2, 15-H2, 17-H), 1,43 (s, COCOCH3), 4,33 (m, 14-H), 4,43 (m, 16-H), 4,70 (d, J = 11 Hz, 4-H), 5,05 (m, 8-H), 5,2-5,9 (m, 3-H, 6-H, 7-H, 10-H, 13-H), 6,15 (d, J = 15 Hz, 12-H), 8,07 (d, J = 10 Hz, NH). IR-spektrum (KBr): 3475,1728,1706,1672,1256,1234 (váll), 1012,960 cm-1. 14 14. referenciapélda Lankacidin C előállítása 405 mg lankacidin C-8,14-bisz-(2,2,2-triklór-etil-karbonát)-ot feloldunk 10 ml diklór-metán és 1 ml ecetsav elegyében. Az oldathoz ezután 810 mg cinkport adunk, majd a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 5 órán át kevertetjük. A reakcióelegyhez ezután etil-acetátot adunk, majd az oldhatatlan anyagot szűréssel eltávolítjuk, és a szűrletet bepároljuk. A bepárlás utáni maradékot 50 g szilikagélt tartalmazó kromatográfiás oszlopon kromatografáljuk, eluálószerként tetrahidrofurán és kloroform (1 : 2) elegyét használva. 10 g-os frakciókat gyűjtünk. A 20-28 frakciókat egyesítjük, majd az oldószert desztillációval eltávolítjuk. A desztillációs maradékhoz dietil-étert adunk. A cím szerinti vegyület kikristályosodik. 45,5 mg cím szerinti vegyületet kapunk, aminek NMR- és IR-spektruma, valamint VRK kromatogramja megegyezett a fermentációs módszerrel előállított lankacidin C ugyanezen jellemzőivel. 15. referenciapélda Lankacidin C előállítása 60.4 mg lankacidin C-8,14-bisz(trimetil-szilil)-étert feloldunk 1 ml tetrahidrofuránban. Az oldathoz 0,3 ml 1 n sósavoldatot adunk, és a reakcióelegyet 10 percen át szobahőmérsékleten kevertetjük. A reakcióelegyhez ezután etil-acetátot adunk, majd az etil-acetátos oldatot vízzel, nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldatával, majd vizes sóoldattal mossuk, ezután nátrium-szulfáton vízmcntcsítjók. Az oldószert desztillációval eltávolítjuk. 50,5 mg cím szerinti vegyületet kapunk. A kapott termék NMR- és IR-spektruma, valamint VRK kromatogramja megegyezett a fermentációs módszerrel előállított lankacidin C ugyanezen jellemzőivel. 16. referenciapélda Lankacidin C előállítása 20,6 mg lankacidin C-8,14-bisz(dimetil-terc-butil-szilil-éter)-t feloldunk 0,5 ml tetrahidrofuránban. Az oldathoz 0,1 ml 2 n sósavoldatot adunk, majd a reakt lóelegyet szobahőmérsékleten 2,5 órán át kevertetjük. A reakcióelegyhez ezután etil-accátot adunk, majd vízzel, nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldatával és sóoldattal mossuk. Ezután nátrium-szulfáton vízmentesítjük, majd az oldószert deszüllációval eltávolítjuk. A desztillációs maradékot preparatív vékonyréteg kromatográfiás módszerrel tisztítjuk. (Preparatív lemez: Merck No. 5715, 20 x 20 cm, kifejlesztő oldószer: etil-acetát) 17.4 mg cím szerinti vegyületet kapunk. A kapott termék NMR- és IR-spektruma, valamint VRK kromatogramja megegyezett a fermentációs módszerrel előállított lankacidin C ugyanezen jellemzőivel. 17. referenciapélda 8-dehidroxi-8-klór-lankacidin A előállítása 501 mg lankacidin A-t feloldunk 5 ml diklór-metánban. Az oldathoz 89 pl piridint adunk, majd a reakcióelegyet 8 °C-ra lehűtjük. A reakcióclegybe ezután 80,2 pl tionil-kloridot csepegtetünk. A reakcióelegyet ugyanezen a hőmérsékleten 30 percen át kevertetjük, majd jeges vizet adunk hozzá. A reakcióelegyet ezután diklór-metánnal extraháljuk, az extraktumot magnézium-szulfáton vízmentesítjük. A víztelenített szerves fázisból az oldószert desztillációval eltávolítjuk. A desztillációs maradékot 50 g szilikagélt tartalmazó kromatográfiás oszlopon kromatografáljuk, eluensként etil-acetát-kloroform (1:4) elegyét használva. 15 g-os frakciókat gyűjtünk. A 11-23. frakciókat egyesítjük, majd az oldó5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
