202183. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyulladásellenes diarilszármazékok előállítására
21 HU 201 183 B 22 A kísérletek eredményeit a II. táblázatban foglaljuk össze: II. táblázat LTB4 indukált aggregáció inhibiálása Példa szám Hatóanyag koncentráció 10 5 m lO^m 10'7m 3 _ 84 2 20 — 78 32 22 — — 83 23 92 46 — 29 — 72 14 33 — 94 45 45 77 11-46 — 73 7 47 80 50 2 52 94 89 38 54 — 88 12 75 93 69 15 79 92 87 46 81 76 63 8 90 85 79 9 A leukotrién B4 antagonista hatást az alábbi tesztvizsgálattal mutattuk ki: Emberi perifériás neutrophilen való 3H-LTB4 megkötődés inhibiálása A találmány szerinti vegyületek hatásosságát mértük annak segítségével, hogy hogyan inhibiálják a leukotrién B4 megkötődésétegy specifikus receptoron az emberi neutrophil membránján és erre egy radioaktív-ligandum megkötődesi próbát alkalmaztunk, amelyet Goldman és Goetzl, J. Immunoi., 129, 1600 (1982), dolgozott ki. Más kutatók hasonló próbákat dolgoztak ki [lásd például Kreisle és munkatársai, J. Exp. Mcd., 157, 628 (1983) és Lin és munkatársai, Prostaglandins, 28, 837 (1984) közleményeit.] A kísérletben alkalmazott sejteket standard Ficoll- Hypaque dextrán 70 szedimentációs és kisnyomású sejtroncsoló centrifugálással nyerjük. Az alábbi eljárást alkalmaztuk. Frissen preparált álhártyás burokréteget nyertünk két egyéntől egy helyi véradóközpontban. A sejteket kevertük majd 484 ml-re hígítottuk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal, amely heparint (10 egység/ml), valamint hővel aktivált borjúszérumot tartalmazott. Ezt 20 ml részletekre osztottuk és ezeket a részleteket Ficoll-Paque-ra (12 ml) rétegeztük. Ezután az anyagot 500 g erővel 40 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A vérlemezek és monomagvú sejtek felső rétegét eldobtuk. Az alsó réteget, amely vörösvérsejteket és neutrophileket tartalmazott, megőriztük. Ezután puffert (1 ml/4 ml-ként az alsó rétegre) adtunk hozzá és elkevertük. Ezen keverék minden ml-hez 0,33 ml Macrodex-et adtunk. Elkeverés után a sejteket 37 'C-on ülepedni hagytuk 1 óráig. A kapott erythrocita labdacsot eldobtuk és a neutrophilben dúsult felúszót 10 percig 4 'C-on 500 g erővel centrifugáltuk. Az ezen sejtmaradékban jelenlévő maradó erythrocitákat roncsoltuk a sejteket 5-B ml jéggel hűtött desztillált vízben 30-45 másodpercig inkubálva. Ezután a térfogatot jéggel hűtött pufferrel 50 ml-re egészítettük ki és a sejteket újra szuszpendáltuk. A szuszpenziót ezután 300 g erővel 10 percig 4 'C-on centrifugáltuk. A sejteket végül újra szuszpendáltuk és 2 x Hr sejl/ml koncentrációt állítottunk be a kísérletben alkalmazott pufferben. Ez a puffer Hanksféle kiegyenlítetlen sóoldatból és 0,1% tojásfehéije-albuminból (pH 7,3) áll. Az izolációs eljárás a ncutrophilek 90%-át megőrizte és ezek 90%-ban rendelkezésre állnak (életképesek). A radioaktív ligandum megkötési kísérletet a neutrophilck (1 x 1(U sejt) 0,1-0,2 nmól 3h-:LTB4 (spec, aktivitás 150-220 Curie/mol) és a tesztvizsgálatba vitt vegyület (1 x 10-5 mól és 1 x 10^ mól) inkubálásával végeztük 10 percig 4 'C hőmérsékleten. Ezután a 3HLTB4 megkötött mennyiséget mértük és összehasonlítottuk a vizsgált vegyület jelenléte nélkül mért megkötött mennyiséggel. A kísérletet mikrocentrifuga-csövekben végeztük, amelyekben először 10 mikro 1 DMSO- ban oldott vizsgált vegyületet, majd 20 mikro 1 3HLTB4-t adtunk, amely a kísérletben alkalmazott puffcrrel hígított, és végül 500 mikro 1 sejtszuszpenziót adagoltuk. A 10 perces inkubálás végén 300 mikro 1 dibutil- és dinonil-ftalát (7 : 2) elegyét adtunk a csövekbe és azokat 2 percig mikrocentrifugában centrifugáltuk. A sejttömeghez kötött radioaktivitást szcintillációval mértük. Az eredményeket a III. táblázatban közöljük. III. táblázat LTB4 megkötődés inhibiálása Példa szám 10‘5m Hatóanyag koncentráció 10‘6m 10' 2-11 14 _ 3 76 26-4-5-1-12 3-1-15-13 1-17 81 20-20 71 35-21 74 23-22 95 62 17 23 87 52 4 24 93 28-26 63 10-27 80 18-28 96 55 — 29 98 71 11 32 19-6-33 100 79 17 35 53 2 — 40-14-10-44 41 11-45 78 19-46 91 55 13 47 59 2-3 48 10-10 — 50 88 41-52 92 61 17 54 71 37-56 88 41 — 75 97 82 36 76 96 91 36 77 22 8 — 78 18 4 — 79 100 97 92 80 105 98 68 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
