202183. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyulladásellenes diarilszármazékok előállítására
19 HU 201 183 B 20 A dózisérték annak az antagonists koncentrációnak felel meg, ami az 50 százalék maximális választ eltünteti (ED») amennyiben az antagonistát beadagoljuk osztva az antagonists nélküli ED» értékkel. A számításokat számítógép és digitális kiíró segítségével végeztük. Ez- 5 után a pA2-t mint a KB negatív logaritmusát számoltuk amennyiben a Schild görbe meredeksége nem különbözik jelentősen egytől. Az (I) általános képlett! vegyületek tesztvizsgálatainak eredményét az I. táblázatban foglaljuk össze. I. táblázat Az (I) általános képletü vegyületek LTDr gyei szembeni antagonista hatása Vegyület Példa szám pA2* 3 63 7 6,8 20 6,0 21 5,85 22 5,71 24 6,4 25 63 28 6,49 29 6,02 33 5,94 34 5,72 45 5,7 48 5,1 52 6,18 56 6,32 66 634 * Becsült A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek ezen túlmenően leukotrién B4 receptor antagonista hatással is rendelkeznek. így képesek az ilyen leukotrién biológiai hatását, mint a neutrophil aggregációt, a chemotaxist, a degranulálődást blokkolni, amint azt az alábbi vizsgálatokban kimutattuk. LTB4 indukált aggregációs próba Neutrophileket mutatunk ki két hím Hartley tengerimalacnak 20-20 ml Dulbecco kálcium és magnézium hiányos foszfát puffereit fiziológiás sóoldatot (PBS) intraperitoneálisan injektálva, amely 2% osztriga gliko- 50 gént tartalmaz. 18 órával később a hasüregben felgyűlt sejteket kinyerjük a hasüreget körülbelül 100 ml PBS- sel mosva, amely 10 egység/ml heparint tartalmaz. A sejteket 8 percig 200 g erővel centrifugáljuk, majd a felúszó folyadékot eldobjuk. Az üledékben jelenlévő erythrocytákat a sejtek 9 ml jegesen hűtött desztillált vízzel történő 30 percig folytatott erős keverésével lebontjuk. A fiziológiás ozmotikus jellemzőt 1,5 ml 0,6 mólos KC1 hozzáadásával állítjuk be. 12 ml PBS-t 10 adunk az elegyhez és az újraszuszpendált sejteket 200 g erővel 4 'C-on 8 percig centrifugáljuk. Az üledéket 5 ml PBS-ben újra szuszpendáljuk. A sejtkoncentrációt meghatároztuk és további puffert adunk az elegyhez, hogy a koncentráció 1 x ÍO7 sejt/ml legyen. Ezzel az izolációs 15 eljárással 90%-os neurophii preparátumot kapunk, amely nagyobb mint 90% életképességű. Az aggregációs próbát a LTB4 által indukált sejt aggregációt Payton egycsöves aggragométerrel, 300B modell, mérve végezzük. A berendezést úgy kalibráljuk, 20 hogy behelyezzük a sejt szuszpenziót tartalmazó küvettát és a nullázó gombot úgy állítjuk be, hogy a kijelző 1 mV-ra álljon be. Ezután egy 20%-kal kevesebb sejtet tartalmazó küvettát helyezünk be és a kimenetb gombját úgy állítjuk be, hogy a kijelző 9mV értékre álljon be. 25 Ezzel a beállítással 8 mV változás a regisztráló toll 200 mm-es elmozdulását okozza. Amikor a próbát végezzük minden küvettába 0,5 ml sejtszuszpenziót adunk (5 x 10"* sejt). Ezután 5 mikroliter vizsgált vegyidet oldatot adunk hozzá. A legtöbb vizsgált vegyületet ere- 30 detileg DMSO-ban oldjuk 1 x 10"2 mólos koncentrációban, majd PBS-sel hígítjuk úgy, hogy a vizsgált vegyidet koncentrációja 1 x 10-3 és 1 x lfr7 mól közötti legyen és a vizsgált minta DMSO koncentrációja 0,1 % vagy ennél kisebb legyen. Néhány vízben kevésbé oldható anyagot 35 először DMSO-ban 1-6 x 10-3 mólos koncentrációban oldunk, majd PBS segítségével megfelelően hígítjuk. A DMSO koncentrációja a vizsgált mintában sohasem volt 1 %-nál nagyobb. 2 perc egyensúly beállási idő után a sejtek és a vizsgált vegyület között, 5 mikroliter CaCl2 40 (100 mmól), és MgG2 (50 mmól) tartalmú oldatot adunk a mintához. Egy perccel később 5 mikroliter PBS-t adagolunk be, amely LTB4-t (3 x ÍO7 mól) tartalmaz. A következő perc alatt az átbocsátót! fény mennyiségében beálló változást mérjük. A vizsgálandó vegyület 45 jelenléte nélkül a LTB4 mennyisége általában 120- 150 mm regisztráló toll elmozdulást okozott. Jellemző kísérlet során számos LTB4 által indukált aggregációmérést végzünk és az átlagot határoztuk meg. A vizsgált vegyület hatását az aggregációra az alábbi képlettel számítottuk; Százalékos _ Aggregáció LTB4 hatásra - Aggr. LTB4 + vizsgált vegyület hatásra inhibiálás Aggregáció LTB4 hatásra 11
