202063. lajstromszámú szabadalom • Nyújtott hatású biológiai peszticidet tartalmazó készítmény és eljárás a hatóanyag és a termelő sejtek előállítására
HU 202063B 9 10 két elöljük, ezek azonban megőrzik toxicitásukat Trichoplusiani lárvák ellen, A Bacillus thüringiensis (HD-1) érintetlen sejtjeit centrifugálással kinyerjük éppen a spórázó sejtek autolízise előtt, és a sejt-üledéket ionmentesített vízben szuszpendáljuk, 6,0.10E9 sejt/ml koncentrációt adva. Asejtszuszpenzió egy alikvotját 1.5.10E8 sejt/ml-re hígítjuk és 1%-os lugol jód hatásának tesszük ki 4 órán át szobahőmérsékleten (az 1%-os lugol jód oldat l,0gkálium-jodidot,0,5gjódotés 1,0 ml jégecetet tartalmaz 1 literben). A kezelt sejteket mossuk és újra szuszpendáljuk steril, ionmentesített vízben, hogy 6,0.10E9 sejtkoncentrációt nyerjünk. Élő sejtet nem muta tunk ki lemez-számlálásos módszerrel táp-agaron 4 órás jódos kezelés után. Alugol oldattal kezelt és a nem kezelt kontroll sejteket ezután biológiai mérésnek vet jük alá T. ni lárvák elleni toxieitásra. Mivel a jelen találmány szerinti sejtek természetben előforduló sejtek, nem szükséges kezelni ezeket pusztító körülmények között abból a célból, hogy a jelen találmány előnyeit realizáljuk. így a se j -10 15 20 tek kezelését, amint itt leírjuk, optimalizálni képes bárki, aki a szakterületen jártas, hogy elérje a toxin (peszticid) aktivitása meghosszabbításának legmagasabb szintjét a cél kártevő(k) környezetében. B. A biológiai mérési folyamat Lugol oldattal elölt sejtek vagy kezeletlen élő HD-1 sejtek hígításait összekeverjük állandó térfogatú lárva-táplálék adaggal. Egy egyedi, 5napos T. ni lárvát teszünk ezután mindegyik táplálék-adaghoz. 18 lárvát vizsgálunk meg hígításonként. A lárvákat 6 nap után megvizsgáljuk és az elpusztult lárváit számát rögzítjük. Az eredményeket az 1. Táblázat mutatja be. Ez az elpusztul t lárvák százalékát adja meg. 2. példa Stabüitásvizsgálat Bacillus thüringiensis érintetlen, spórát tartalmazó sejtjeit kezeljük 1%-os lugol oldattal 4 órán át szobahőmérsékleten, ionmentesített vízzel mossuk, és hűtőszekrényben tároljuk 52 napon át. Ezután az időtartam után is egészben marad a sejt, nincsen bizonyíték a lízisre (spórák és kristályok kibocsátása). Bacillus thüringiensis érintetlen, spórát tartalmazósejtjeit centrifugálással kinyerjük és az ígylétrejött üledéket steril, ionmentesített vízben szuszpendáljuk (10E10 sejt/ml), 70 *C hőmérsékleten kezeljük 30 percen át és hűtőszekrényben tároljuk 9 zünk steril, 500 ml-es lombikba, és 200 ml kísérleti 25 oldatot adunk hozzá. 2. Sterü talaj-preparátum: 40 g talajt helyezünk steril, 500 ml-es lombikba, és 1 órán át autoklávozzuk, mielőtt 200 ml kísérleti oldatot hozzáadnánk. A 1. táblázat Lugollal kezelt érintetlen, spórát tartalmazó Bacillus thüringiensis (HD-1) sejtek biológiai mérése Sejt hígítás 10E9 10E8 10E3 * * * 7 10E6 10E5 HD-1, kezeletlen 100 100 68,8 0 0 Lugollal kezelt 94,4 61,0 0 0 0 napig. Ezután az időtartam után láthatóan az összes sejt lizálódott, spórákat és kristályokat bocsátva ki. 3. példa Talaj-kísérleti folyamat Bacillus thüringiensis HD-1 készítmény Bacillus thüringiensis HD-1 érintetlen spórát tartalmazó tenyészetét centrifugálással kinyerjük és a sejtüledéket újra szuszpendáljuk 400 ml 1%-os lugol jódoldatban (4.10Eysejt/ml). A jódos sejtszuszpenziót 3 órán át szobahőmérsékleten kevertetjük, háromszor mossuk és újra szuszpendáljuk 400 ml steril, 0,1 mól/literes nátrium-foszfát pufferban, pH 6,9. Nem tudunk élő Bacillus thüringiensis HD-1 sejtet kimutatni tápagaron (10E'1) jóddal történő kezelés után, és a mikroszkópos kezelés feltárja, hogy az összes sejt érintetlen (nem lizált). Dipel készítmény: Dipelt(0,l g.AbbatLaboratories, 16000nemzetközi potenciál-egység/mg; 5188. listaszám), amely Bacülus thüringiensis HD-1 sejteket tartalmaz, mérünk 400 ml sterü, 0,1 mól/literes nátrium-foszfát pufferba. Kísérleti felállítás: 1. Nem sterü talaj-preparátum: 40 g talajt helyetalaj-szuszpenziókat tartalmazó lombikokat forgó rázógépen (200 fordulat/perc) inkubáljuk, szobahőmérsékleten. Az egyes talaj-szuszpenziók30-40mles mintáit 4 rétegű sajtkendőn átszűrjük és saláta 45 növény leveleire permetezzük, hogy ezt követően mérhessük a toxieitást T. ni lárvái ellen. B. thüringiensis toxin mérése táplálás-gátlással levél gátlási méréssel Romaine saláta palánta leveleit frissen készített 50 Dipel standard koncentrációkkal (1.0,19 g/100 ml, 1/10,1/20 és 1/100) permetezzük, és kísérleti oldatokkal, 24 órával felhasználás előtt. A standardokkal és kísérleti oldatokkal kezelt leveleket eltávolítjuk a növényekről, egyedileg lemér- 55 jük, és egy-egy petricsészébe helyezzük. Tíz éhező, 7 napos T. ni lárvát alkalmazunk mindegyik levélhez, és hagyjuk ezeket táplálkozni a levélen mintegy 24 órán át 25 ’C hőmérsékleten. A táplálási időtartam végén a leveleket újra mérjük és az átlagos súlyvesz- 60 teséget meghatározzuk minden egyes kezeléshez. A fentebb leírt körülmények között a levél súlyvesztesége logaritmikus-lineáris függvénye a toxinkoncentrációnak 0,19 mg/ml-0,019 rag/ml Dipel oldattal egyenértékű tartományban (16000 nemzet- 65 közi potenciál-egység/mg). ígyafrissenkészítettDi-6
