202063. lajstromszámú szabadalom • Nyújtott hatású biológiai peszticidet tartalmazó készítmény és eljárás a hatóanyag és a termelő sejtek előállítására
HU 202063B pel oldatok koncentrációit permetezzük saláta-növényre és mindenegyes koncentrációnál a mérést elvégezzükhogyezstandardkéntszolgáljon.ehhezlehet azután hozzámémi a levelekre permetezett kísérleti Bacillus thüringiensis HD-1 toxin oldatok 5 különböző koncentrációit. A2. Táblázatban található adatok megmutatják az eredeti toxicitás százalé-A Bacillus thüringiensis HD-1 fehérje-kristály inaktiválását a talaj mikroorganizmusainak aktivi- 10 tása miatt mutatjuk be (West, 1984). A 2. táblázat eredményei azt demonstrálják, hogy amikor Dipel-t és elő-lizált, lugolos jód-oldattal kezel t Bacillus thüringiensis HD-1 készítményt azonos körülmények 11 kában (1 nap), hogy különböző időtartamokig talajban inkubálva, majd ezt követően levél-gátlási méréssel mérve milyen a maradék aktivitás. Nemcsak saláta levelét, hanem más növények leveleit is lehet alkalmazni a Bacillus thüringiensis hatékonyságának mérésében. (Kbp) Hindin DNS fragmenst tartalmaz, amely magában foglalja a 8-endotoxin gént a Bacillus thüringiensis HD 73 50 md-s plazmidjából. Megfelelő toxin fejeződik ki ebből a génből E. coliban, hogy az érintetlen sejtet toxikussá tegye káposztalepke hernyó ellen. A DNS fragmens további módosítását vé-12 2. táblázat A toxicitás megmaradása talajban, az eredeti toxicitás megmaradásának %-ában Napok száma a Dipel (spóra-kristály talajban való készítmény) inkubálás kezdetétől Elő-lizált, lugol-jód oldattal kezelt Bacillus thüringiensis HD-1 (teljes sejt készítmény) steril nem steril steril nem sterü 1 100 100 100 100 5 81 0,5 133 100 8 74 5,3 80 76 15 — 87 117 között inkubálunk, a Dipel (spóra-kristály) készítmény gyorsan degenerálódik, míg a lugolos jód-oldattal kezelt sejtek lényegében változatlanok maradnak. A fenti eredményekből nyilvánvaló, hogy a teljes 35 mikrobiológiai sejt kémiai kezelését olyan módon lehet végrehaj tani, hogy a polipeptid toxin aktivitása megmaradjon, ugyanakkor a sejt is stabil marad a tárolás körülményei között. Ez megnövekedett maradék toxin-aktivitást eredményez a szabadföldi 40 körülmények között. 4. példa Heterológ gén megalkotása és transzformálás megfelelő gazdaszervezetekbe 45 A megoldást Pseudomonsa aeruginosa klónnal kezdjük, amely a Northern Regional Research Laboratories-től szerezhető be (NRRL B-12127), amely a széles gazdaszervezet-tartománnyal bíró pR01614 „ingázó” plazmiddal rendelkezik [J.Bact. 50 150.60 (1982); és 4.374.200. lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. A plazmidnak egyedi HindlTT. BamHT. Sáli és PvuIT restrikciós helyei vannak, egy EslI beiktatása, amely a karbenicillin rezisztencia gént foglalja magában, és egy 55 P. aeruginosa replikációs rendszere, ahol a Hindiik BamHI és SaU restrikciós helyek egy letraciklin rezisztencia génen belül vannak. A plazmid további részei pBR322-ből származnak. Egy másik plazmid, a pSMI-17 is letétbe van helyezve, min t E. coli klón- 60 ja (NRRL B-15976). A letétbe behelyezés a Northern Regional Research Laboratory-nál (U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, USA) történt. A pSMl-17 plazmid ampicillin rezisztenciát ad E. colira és egy 6,8 kilobázispáros 65 gezzükel,hogynöveljüka toxin kifejeződését ésvégrehajtsuk a toxin kifejeződését egy másik gazdaszervezetben, Pseudomonas fluoresccnsben is. Abból a célból, hogy eltávolítsuk a nem kívánt DNS-t a 6,8 Kbp-s fragmensről, a pSMl-17-et BamHI-el emésztjük, hogy a köralakú plazmidot annál a helynél nyissukki, amely a legközelebb van a toxin gén 5’ végétől, és Bal 31 exonukleázzal kezeljük, hogy a 6,8 Kbp-s Hindin beiktatást mintegy 2,9 Kbp-re csökkentsük. ADNS szabad végeit Klenow-polimerázzal kitöltjük, BanHI kapcsolókat (linkereket) adunk hozzá, és a lineáris DNS-t ligáljuk, hogy újra képezzük a köralakú plazmidot. Az így létrejött pFG270 plazmidot Xhol-el emésztjük, hogy a köralakú plazmidot annál a helynél nyissuk ki, amely legközelebb van a toxin gén 3’ végéhez. Sáli kapcsolókat adunk hozzá, a plazmidot köralakú formájában ligáljuk, és az így létrejött pFGl 0.6 vektort E. coliban szaporítjuk. A pFG0.6-ot Sall-cl és BamHI-el teljesen emésztjük és az így létrejött 2,1 Kbp-s fragmenst, amely a toxin gént tartalmazza, gélclektroforézisscl tisztítjuk, és a pR01614 plazmid BamHI és Sáli helyeire ligáljuk Az így létrejött pCH2.1 plazmidot E. coliban szaporítjuk, és Pseudomonas fluorescens transzformálására alkalmazzuk, karbanicillin rezisztenciát adva át, és azt a képességet, hogy 8-endotoxiut szintetizáljon. A Pseudomonas fluorescens (pCH2.1)-et az NRRL-nél letétbe helyeztünk ahol az az NRRL B-15977 le téti számot kapta. A pSM 1 - 17 és a pCH2.1 plazmidokat a letéti helyen 1985. j úlius 2-án helyeztük letétbe. A következő bemutató kísérletekben P. fluorescens (pCH2.1)-et alkalmazunk nem-transzformait sejtekkel, mint kontrollal együtt. Az E. coli (pSM 1-17)—NRRL B-15976 és P. 7
