202063. lajstromszámú szabadalom • Nyújtott hatású biológiai peszticidet tartalmazó készítmény és eljárás a hatóanyag és a termelő sejtek előállítására
HU 202063B 7 8 szabályozható represszor által, lásd pl. a 4.347.920. lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást. A promoter megfelelő kiválasztása függ egy sor tényezőtől, a promoter erősségétől, a promoter hatásától a sejtek életképességére, a sej tre 5 endogén szabályozó mechanizmus hatásától a promotorrastb.Nagyszámúpromotorállrendelkezésre sokféle forrásból, beleértve kereskedelmi forrásokat is. A heterológ peszticid gént tartalmazó celluláris 10 gazdaszervezetet lehet növeszteni bármilyen alkalmas tápközegen, ahol a DNS konstrukció szelektív előnyt nyújt, szelektív tápközeget alkalmazva olyan módon, hogy az összes vagy lényegében az összes sejt megtartsa a heterológ gént. Ezeket a sejteket lehet 15 azután hagyományos módokkal összhangban kinyerni és módosítani az alább leírt különbözhő módokon. Egy másikmódszer szerinta sejteket a kinyerés előtt rögzítjük. A toxint tartalmazó gazda-organizmust kezel- 20 hetjük acélból, hogy; először, növeljük a szerkezeti sértetlenséget; másodszor, hogy a toxin megnövekedett proteolitikus stabüitását megnyújtsuk, a toxint olyan módon módosítva, hogy csökkenjen érzékenysége a proteolitikus lebomlásra, és/vagy a sej t- 25 ben természetes módon jelen levő proteázok proteolitikus aktivitása csökkenjen. A sejteket előnyösen érintetlen stádiumban módosítjuk, és amikor a toxin fehérje lényeges felépítése történik. Ezeket a módosításokat különböző utakon lehet elérni, mint pl. szé- 30 les kémiai reaktivitás spektrummal rendelkező vegyi reagensek alkalmazásával. Az érintetlen sejteket kombinálhatjuk a kémiai reagenseket tartalmazó folyékony reagens közeggel, keveréssel vagy anélkül, -10 °C és 60 ’C közötti hőmérséklettartomány- 35 ban. A reakcióidőt empirikusan lehet meghatározni és ez nagymértékben változhat a reagensektől és a reakciókörülményektől függően. A sejtkoncentráció kb. 10Ezés 10E10/ml között változhat. Különösen alkalmas kémiai reagensek a halogén- 40 ezőszerek, különösen a 17-80 rendszámú halogének. Legcélszerűbben jódot alkalmazhatunk enyhe körülmények között és megfelelő ideig, hogy elérjük a kívánt eredményt. Más technikák is alkalmazhatók: a kezelés aldehidekkel, pl. formaldehiddel és 45 glutáraldehiddel; fertőtlenítőszerekkel, pl. zephiran kloriddal és cetil-piridinium-kloriddal; alkoholokkal, pl. izopropanollal és etanollal; különböző szövettani rögzítővel [lásd; Humason, GretchenL.: Animal Tissue Techniques (Állati szövettechnikák), kiadó: 50 W. H. Freeman és Company, 1967]; vagy a fizikai (hő) kezelés kombinálása kémiai szerekkel, hogy meghosszabbítsuk a sejtben termelt toxin aktivitását, amikor a sejtet a cél kártevő(k) környezetében alkalmazzuk. 55 A jóddal végzett halogénezésnél a hőmérséklet általában 0 és 50 'C közti tartományban van, de a reakciót kényelmesen kivitelezhetjük szobahőmérsékleten. Véghezvihetjük a jódozást trijodidot vagy jódot alkalmazva 0,5-5% koncentrációban savas vi- 60 zes közegben, különösen vizes karbonsavas közegben, amely 0,5-5 mól/liter közt váltakozhat. Előnyös, ha ecetsavat alkalmazunk, bár más karbonsavak, általában 1-4 szénatomszámú karbonsavak, szintén alkalmazhatók. A reakcióhoz szükséges idő 65 1 perctől 24 óráig terjedő tartományban van, általában 1 és 6 óra között. Minden maradék jódot el lehet távolítani redukálószerrel, pl. ditionittal, vagy nátrium-tioszulfáttal végzett reakcióval, vagy más redukálószerekkel, amelyek alapvetően összeférhetők a mezőgazdasági területen való felhasználással. Ezen kívül a módosított sejteket további kezelésnek is ki lehet tenni, pl. mosásnak, hogy cltávolítsuk az összes reakcióközeget, izolálásnak száraz formában, és kiszerelésnek a szokásos permet-tapadást fokozó anyagokkal, szórás-elősegítő anyagokkal és adjuvánsokkal, amelyeket mezőgazdasági hasznosításban általánosan alkalmaznak; mindezek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. Különösen előnyösek azok a reagensek, amelyek képesek keresztkötéseket létesíteni a sej tfalban. Erre a célra a szakirodalomban egy sor reagens ismeretes. Akezelés a peszticid megnövekedett stabilitását kell, hogy eredményezze. Ez azt jelenti, hogy a peszticid megnövekedett állandósága és maradék aktivitása érvényesül a mezőgazdasági felhasználás körülmények között is. így olyan körülmények között, ahol a kezeletlen sejt peszticid-aktivitása csökken, a kezelt sejt aktivitása 1-3-szór hosszabb időtartamon keresztül megmarad. Asejteket számos formában lehet kiszerelni. Lehet alkalmazni nedvesíthető porokként, szemcsékként vagy porokként, különböző inert anyagokkal keverve, üyen anyagok lehetnek pl. szervetlen anyagok (filloszilikátok, karbonátok, szulfátok, foszfátok stb.), vagy növényi anyagok (kukoricacsutka-őrlemény, rizskorpa, dióhéj stb.). A kiszerelési forma magában foglalhat permet-tapadást fokozó anyagokat, szórás-elősegítő anyagokat, stabüizálószercket, egyéb peszticid hozzátéteket, vagy felületaktív anyagokat. A folyadék formájú kiszerelés lehet vízalapú vagy nem víz-alapú, és lehet alkalmazni habként, gélként, szuszpenzióként, emulziót kialakító koncentrátumként stb. A kiegészítő anyagok lehetnek reológiai tulajdonságokat befolyásoló szerek, felületaktív anyagok, emulgeátorok, diszpergálószerek vagy polimerek. A peszticid-koncentráció széles határok között változhat, a szóban forgó kiszerelés természetétől függően, különösen attól függően, hogy ez koncentrátum vagy közvetlenül felhasználható készítmény. A petszticid legalább 1 tömeg% formában van jelen, de lehet 100 tömeg%-ban is. A száraz kiszerelések általában 1-95 tömeg% közti peszticid mennyiséget tartalmaznak, míg a folyékony kiszerelések 1 -60 tömeg% szilárd anyagot tartalmaznak a fojyadékfázisban. A kiszerelések általában kb. 1EZ és 1E4 sejt/mg közti mennyiséget tartalmaznak. Ezeket a kiszereléseket kb. 2 oz-tól (folyadék vagy száraz) 2 vagy több lb/ha-ig (2 oz- 2 uncia- 56,7 g; 1 lb- 2 font-907,2g). A kiszereléseket a kártevő(k) környezetében lehet alkalmazni, pl. növényeken, talajban vagy vízben porlasztva, porítva, szórva stb. Az alábbi példák bemutatás céljait szolgálják, és nem céljuk a korlátozás. 1. példa B. thüringiensis érintetlen (autolízis előtti) spóratartó sejtjeinek kezelése után lugol-jóddal, a sejte-5
