202063. lajstromszámú szabadalom • Nyújtott hatású biológiai peszticidet tartalmazó készítmény és eljárás a hatóanyag és a termelő sejtek előállítására
HU 202063B vastag sej tfalak, pigmentáltság, sej ten belüli bezártság vagy bezárt testecskék keletkezése; affinitás a levelekhez; az emlősökre való toxicitás hiánya; tetszőlegesség a kártevők számára az elfogyasztás céljából; a pusztítás és rögződés könnyűsége a toxin károsodása nélkül stb. További megfontolások pl. a könnyű formulázhatóság és kezelhetőség, gazdasági szempontok, tárolási stabilitás stb. Különösen érdekesek gazda-organizmusként az élesztők, mint a Rhodotorula faj, Aureobasidium faj, Saccharomyces faj és Sporobolomyces faj; levélen élő organizmusok, mint a Pseudomonas faj, Erwínia faj és Flavobacterium faj; vagy egyéb organizmusok, mint az Escherichia, Lactobacillus faj, Bacillus faj stb. Különösen alkalmas organizmusok erre a célra a Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thüringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis stb. Asejt általában érintetlen és lényegében szaporodó (proliferativ) formában van, amikor elöljük, inkább, mint spóra formában, bár bizonyos esetekben spórákat is lehet alkalmazni. A sejteket lehet gátolni a szaporodásban különböző módokon, feltéve, hogy a technika nem ható károsan a peszticid tulajdonságaira, vagy nem csökkenti a celluláris képességet a peszticid megóvásában. Ezek a technikák lehetnek fizikai kezelések, kémiai kezelések, változásokatokozókasejtfizikai jellegében vagy a sejt fizikai jellegét lényegében érintetlenül hagyok egyaránt. A gazdasejtek inaktiválásához szolgáló technikák pl. a következők lehetnek: hőkezelés általában 50 °C és 70 ’C hőmérsékletek között; fagyasztás; UV-besugárzás, liofilezés; toxinos kezelés, pl. antibiotikumok, fenolok, anilidek pl. karbanilid és szalicilanilid, hidroxi-karbamid; kvaterner vegyületek, alkoholok, antibakteriális festékek, EDTAés amidinek, nem fajlagos szerves és szervetlen vegyi anyagok, pl. klórozó, jódozó és brómozó szerek, aldehidek, pl. glutáraldehid vagy formaldehid, toxikus gázok, pl. ózon és etilén-oxid, peroxidok, psoralcnek, szárítószerek, stb. amelyeket mind lehet alkalmazni egyénüeg és kombinációban is. A szer kiválasztása függ a szóban forgó peszticidtől, a gazdasejt természetétől, a sejtszerkezet módosításának természetétől, pl. a sejtfal rögzítése és tartósítása keresztkötő szerekkel stb. Asejtek általában megnövekedett szerkezeti stabilitással rendelkeznek, amely növeli a környezeti lebomlással szembeni ellenállást a termőföldön. Ahol a peszticid elő-formában van, az inaktiválás módszerét úgy kell kiválasztani, hogy ne gátolja az elő-forma átalakulásának folyamatát a peszticid érett formájábá a cél-kártevő patogén által. így pl. a formaldehid keresztkötéseket létesít a fehérjékkel ésmeggátolhatjaapolipeptid peszticid elő-formájának átalakulását. Az inaktiválás vagy elölés módszere befolyással van a toxin biológiai hozzáférhetőségc és biológiai aktivitása legalábbis jelentős részére. Aheterológ gént vagy géneket a gazdaszervezetbe bármilyen alkalmas módszerrel be lehet vezetni, vagy extrakromoszomális fenntartást biztosítva vagy integrálva a gazdaszervezet genomjába. (A „heterológ” azt akarja jelenteni, hogy a gén nincsen jelen a gazdaszervezetben, amelybe azt bevezetik, és 5 ez ágén normálisan nem is található ilyen gazdaszervezetben. Ez azt jelenti, hogy még ha a gazda organizmus és a heterológ gén cserélnek is információt, a heterológ gén normálisan nem található a vad típusú gazdasejtekben a természetben. Általában a „heterolcg” kifejezés különböző nemzetségek fajtáit foglalja magában, mint gazdaszervezetet és gén-forrást.) Különböző konstrukciókat alkalmazhatunk, amelyek magukban foglalják a plazmidokból, vírusokból vagy centromérákból származó replikációs rendszereket, kombinálva egy autonóm replikáié (ars) szegmenssel a stabil fenntartás érdekében. Ahol csupán az integrálás kívánatos, olyan konstrukciókat alkalmazhatunk, amelyek a replikációról gondoskodnak, és vagy transzpozonok, vagy transzpozon-szerű inszerciós aktivitással rendelkeznek, vagy homológiáról gondoskodnak a gazdaszervezet genomjával. Gyakran alkalmazunk olyanDNSszekvenciákat, amelyek rendelkeznek a szekvenciák közötti heterológ génnel, amely homológ a gazdaszervezet genomjában levő szekvenciákkal, vagy kromoszómái isanvagyplazmiddal. Kívánatos, hogy aheterológ gén több másolatban legyen jelen, lásd pl. 4.399.216. lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást. így a konjugálást, transzdukciót, transzfekciót és transzformálást alkalmazhatjuk a heterológ gén bevezetésére. Nagyszámú plazmid áll jelenleg rendelkezésre, amelyek függnek az eukarió ta és prokarióta replikációs rendszerektől, ilyenek pl. a ColE 1, P1 összeférhetetlen plazmidok, pl. pRK290, élesztő 2mM plazmid, lambda stb. Ahol cxtrakromoszómális elemet alkalmazunk, a DNS konstrukció kívánatosán olyan markért foglal magában, amely lehetővé teszi az ezt a konstrukciót tartalmazó gazdasej teknek a szelekcióját. A marker általában olyan megjelölés, amely valamilyen biológiai anyaggal szemben rezisztenciát biztosít, pl. antibiotikum-rezisztenciát vagy nehézfém-rezisztenciát, vagy komplemen tálás t nyújt, prototrófiát szolgáltatva egy auxotróf gazdaszervezetnek stb. A replikációs rendszerek szolgáltathatnak speciális tulajdonságokat, pl. „elszabadult” (runaway) replikációt, magukban foglalhatnak cos sejteket, vagy más speciális vonások jelentkezhetnek. Ahol a heterológ gén vagy gének átíró és transzlációs kiindulási (iniciációs) és befejező (tcrminációs) szabályozó szignálokkal rendelkeznek, amelyet a gazdasejt felismer, gyakran elegendő alkalmazni ezeket a szabályozó jellemzőket a heterológ génnel együtt. Azokban a helyzetekben azonban, ahol a heterológ gén módosul, így pl. egy vezető szekvenciát eltávolítunk vagy olyan szekvenciát nyújtunk, amely a peszticid érett formáját kódolja, ahol a teljesgén egy prekurzort kódol, gyakran szükséges manipulálni a DNS szekvenciát olyan módon, hogy egy átíró iniciációs szabályozó szekvenciát szolgáltathatunk, amely eltér a természetes szekvenciától. Az átírási iniciációs szekvenciák széles választéka létezik gazdaszervezetek széles választékához. A szekvencia a peszticid konstitutív kifejeződéseit szolgáltathatja, vagy szabályozottkifejeződést, ahol a szabályozás indukálható lehet valamüycn vegyi anyag, pl. egymetabolit, vagy hőmérséklet, vagy egy 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
