201973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin B-származékok előállítására
HU 201973 B 17 pH = 7,2 értékre állítjuk be. AP-5 táptalaj hidrolizált keményítő 80 g/liter Ardamine pH 5 g/liter dikálium-hidrogén-foszfát 1 g/liter magnézium-szulfát-7 víz nátrium-klorid 1 g/liter 1 g/liter kálcium-karbonát 7 g/liter vas(II)-szulfát-7 víz 0,01 g/liter cink-szulfát-7 víz 0,001 g/liter mangán(II)-klorid-7 víz 0,001 g/liter P-2000(habzásgátló)a Imi a The Dow Chemical Co., Midland, Michigan 48640, USA. A táptalaj kémhatását pH = 6,9 értékre állítjuk be 25%-os nátrium-hidroxiddal. Az elmondottak bővebb szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák a találmány oltalmi körét nem korlátozzák. retenciós idő (perc) primer vegyület B2 1. ± 2-metil-vajsav xll,60 12,40 2. ciklopentán-karbonsav 12,32 3. ciklohexán-karbonsav 14,84 4 (+)2-metil-vajsav 11,60 1-4. példa (referencia példák) V-8 lemezen tenyésztett S.avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzzsel beoltunk 80 ml AS-7 táptalajt egy 500 ml-es, háromszorosan horpasztott oldalú Erlenmeyer lombikban. A lombikot percenként 200 fordulatszámú rázógépen rázatjuk 28-30 °C hőmérsékleten. 24 órás inkubálás után nyert tenyészet 1 milliliterével beoltunk egy 300 ml-es lombikban levő 40 ml AP-5 táptalajt. A második fermentálást 28-30 °C hőmérsékleten végezzük. 24 órás tenyésztés után 400 ppm mennyiséget adagolunk az alábbiakban felsorolt primer vegyületből. A 312 órás tenyészetből 2 ml mintát veszünk, és azt 8 ml metanol/acetonitril (390:35) eleggyel keverjük össze. Szűrés után 50 pl szűrletet injektálunk a Beckman Ultrasphere ODS oszlopra (3,9x250 cm). Az oszlopot metanol/acetonitril/víz (89:14:7) eleggyel eluáljuk, 0,8 ml/perc áramlási sebesség mellett. Detektálás 240 nm-nél. A keletkezett ( ± 1- metil-propil-, ciklopentil-, ciklohexil- és + 1-metilpropil-) avermektinek retenciós idejét az alábbiakban adjuk meg: 18 B1 A1 23,1 29,82 25,28 32,96 31,46 41,14 23,1 29,82 5 10 15 20 A2 x14,75 16,10 15,86 19,26 14,75 x Mind a (+)-metil-vajsav, mind a (-)-metil-vajsav beépül az avermektinekbe. Az adott kromatográfiás viszonyok között a ( +) és a (-) avermektiek csak a B2 és az A2 esetében válnak el. 5. példa 500 ml-es háromszorosan horpasztott oldalú Erlenmeyer lombikban levő 100 ml AS-7 táptalajt fagyasztva tárolt S.avermitilis 7881 (ATCC 53692) 40 törzzsel oltunk be. A lombikokat körkörös rázógépen rázatjuk percenként 200 fordulatszám mellett 28-30 °C hőmérsékleten. 28 órás tenyésztés után 5 ml tenyészettel beoltunk egy 500 ml-es, háromszorosan horpasztott lombikban 100 ml AS-7 táptalajt. 45 A lombikot körkörös rázógépen rázatjuk percenként 200 fordulatszám mellett 28-30 °C hőmérsékleten. 24 órás tenyészet 1 milliliterével beoltunk egy 300 ml-es lombikban 40 ml AP-5 táptalajt. A lombikot 28-30 °C hőmérsékleten rázatjuk 200 fordu- 50 lat/perc fordulatszámmal. A 24. órában 400 ppm ciklohexán-karbonsavat adunk a tenyészethez, és 312 óra után 2 ml mintát veszünk, amit az 1. példában leírtak alapján HPLC-vel analizálunk. Ezek között a körülmények között csak avermektin kcm- 55 ponensek mutathatók ki a fermentléből: a ciklohexil B2, 14,84 percnél (54,9 mg/1), a ciklohexil B1 példa száma primer vegyület 7. 3-tiofén-karbonsav 8. 3-furán-karbonsav 9. 2-tiofén-karbonsav 10. 2-metil-epnt-4-énsav 10 31,46 percnél (32,1 mg/1) jelenik meg a kromatogrammon. 6. példa Az 5. példában leírtak szerint végezzük az eljárást, de a ciklohexil-karbonsav helyett 400 ppm ±2-metil-vajsavat adva a tenyészethez. Az összes többi körülmény azonos a 2. példában leírtakkal. A fermentlében csak szek-butil-avermektin B2 (11,60, 12,40 percnél; 63,5, illetve 42,4 mg/1) és szek-butil-avermektin B1 (23,1 perc: 105,5 mg/1) mutatható ki. Az előállított vegyületek 0,001-10 mg/kg dózisban hatékonyak. 7-29.példa Az 5. példa szerinti eljárást ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy az alábbiakban felsorolt eljárás további paraméterei megegyeznek a 2. példában megadottakkal. Az alábbi táblázatban a termékek retenciós időit adjuk meg. avermektin retenciós idő (perc) B2 B1 6,95 13,79 7,81 14,13 7,32 14,7 11,0 22,2
