201973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin B-származékok előállítására
HU 201973 B 15 16 lium-hidrogén-foszfát, 1 g magnézium-szulfát-7- víz, 5 g ardamine PH, 5 g kálcium-karbonát, 1 ml P-2000, 0,01 g vas(n)-szulfát-7-víz, 0,001 g mangén(n)-klorid-4-víz, 0,001 g cink-szulfát-víz, 17 g Bacto agar, desztillált vízzel 980 ml-re kiegészítve. 5 A kémhatását pH=7,0 értékre állítjuk be nátriumhidroxiddal, majd 20 percig sterilezzük 121 °C hőmérsékleten autoklávozva. Sterilizálás után 20 ml steril 5%-os ( ± )-2-metil-vajsav törzsoldatot adunk a táptalajhoz, és a kémhatást pH=7,0 értékre állít- 10 jukbe. Az agaros táptalajra oltott tenyészetet 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk 8-12 napon keresztül. A sejteket (micéliumot) eltávolítjuk az agar felszínéről és 250 mikroliter acetonba visszük. 25 mikroliter 15 acetonos extraktumot felviszünk egy Analtech Silica Gel GF készrétegre. A kromatogrammot 30-40 perces futtatással etil-acetáttal fejlesztjük ki. A lemez megszárítása után 3%-os etanolos vanilinoldattal permetezzük be, és 1-3 percre 100 °C hőmér- 20 sékleten tartjuk. Ezt követően 3% kénsavat tartalmazó etanollal permetezzük le a lemezt, és 10-15 percre visszahelyezzük 100 °C hőmérsékletre. Az avermektin-B-O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező mutánsokat a kromatogramm alapján 25 azonosítjuk. A kromatogrammon megtalálhatjuk az (l-metil-propil)-avermetin-B-komponensek foltjai - Rft 0,54,0,42 értékeknél a Bl, illetve B2 -, viszont hiányoznak az avermektin A komponensek foltjai - 0,69 Rf értéknél az Al, illetve 0,58 értéknél 30 az A2 foltjai. A HPLC analízishez a következő rendszert használjuk; Mozgófázis: 150 ml víz 70 ml acetonitril 35 1 literre metanollal kiegészítve. Oszlop: Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Intruments, Dullerton, CA 92634-3100). Áramlási sebesség: 0,75 ml/perc. Detektálás: 240 nm. 40 Csillapítás (értékenység): 6 közeli A minta hígításához acetonitril/metanol 35:390 térfogatarányú elegyét használjuk. Referens anyagok: (1) 0,5 mg avermektin A2a-t mérünk be egy 45 10 ml-es mérőedénybe és metanollal 10 ml-re feltöltünk; (2) 0,5 mg vizsgálati terméket bemérünk egy 10 ml-es mérőedénybe és metanollal 10 ml-re feltöltünk; 50 100 pl (1) oldatot és 100 pl (2) oldatot mérünk egy kémcsőbe és 800 pl mozgófázist adunk hozzá. 1) az összerázott felmenőéből 1 ml kivétet lecentrifugálunk; 2) annyi felülúszót távolítunk el, amennyi csak 55 lehetséges anélkül, hogy az üledéket felzavarnánk; 3) 100 pl HPLC minőségű vizet adunk az üledékhez, és vortex-szel szuszpendáljuk; 4) 2 ml fenti összetételű hígítóelegyet adunk hozzá és jól összekeverjük; 60 5) a szuszpenziót leszűrjük, a szűrletet HPLC analízisnek vetjük alá. A természetes és nem-természetes avermektinek analíziséhez a fenti HPLC rendszert használjuk. A meghatározás belső standardjaként oligomi- 65 cin A-t használunk. A S.avermitilis fermentációknál csaknem mindig megfigyelhető a HPLC-vel az oligomicin A, mint melléktermék, és a találmányban szereplő mutásnok esetében csak ez az egy termék látható, ha olyan táptalajon tenyésztjük őket, mely nem tartalmaz RCOOH általános képletű vegyületet - ahol R jelentése a fentiekben meghatározott - vagy azzá átalakulni képes vegyületet. Az oligomicin A retenciós ideje általában 12^-14 perc. A retenciós idők aránya pontosabb lehetőséget ad az avermektin termékek azonosítására. Az avermektin termékek általában a következő sorrendben jelennek meg a HPLC kromatogrammon: B2, A2, Bl és Al. természetes retenciós idő avermektinek (avermektin) retenciós idő (oligomicin A) B2b B2a A2b A2a Blb Bla Alb Alá 0,70 0,84 0,90 1,09 1,40 1.83 1.83 2,42 A Bla és az Alb nem válnak el. nem-természetes retenciós idő avermektinek (avermektin) retenciós idő (oligomicin A) ciklopentil B2 0,94 ciklopentil A2 1,23 ciklopentil Bl 1,99 ciklopentil Al 2,62 A különböző napokon felvett kromatogrammon az oligomicin A retenciós ideje között általában 1-2 perc eltérés van. Általában 12,5-14 percnél jelenik meg a csúcsa. A példákban, hacsak az eltérésre nem utalunk, a fenti HPLC rendszert alkalmaztuk. A példákban az alábbi táptalajokat használtuk: AS-7 táptalaj hidrolizált keményítő8 20 g/liter Ardamin PHb 5 g/liter Pharmamediac 15 g/liter kálcium-karbonát 2 g/liter 8 Bacillus licheriformis a-amilázával (Novo Enzymes, Wilton, CT; „Termamyl” néven forgalmazva) hidrolizált keményítő. b Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012, USA. c Traders Protein, Memphis, TN 38108, USA. A táptalaj kémhatását nátrium-hidroxiddal 9
