201973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin B-származékok előállítására
HU 201973 B szubsztituens); ezeket demetil-avermektineknek hívják. A harmadik csoportba tartozó mutánsok egyik helyzetben sem képesek a metilezésre. Schulman és munkatársai [Fed.Proc., 44: 931 (1985)] fokozott B-avermektin termelést érnek el S.avermitilis mikroorganizmusokkal oly módon, hogy a fermentálást szinefungin, S-adenozil-etionin és S-adenozil-homocisztein jelenlétében végzik, mely anyagok gátolják a B-avermektin-O-metiltranszferáz enzimet és ezáltal az ágiikon 5-ös helyzetű hidroxilcsoportjának metilezését. Schulman és munkatársai [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29:620-624 (1986)] leírnak O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező Streptomyces avermitilis mutánsokat is, melyek fokozott mennyiségben termelnek B-vermektin komponenseket. A S.avermitilis mutagenezise elágazó láncú-2- oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsokat eredményez. Ezek a mutánsok már nem képesek jelentős mennyiségű természetes avermektinek termelésére, ha nem tudunk a tenyészethez RCOOH általános képletű vegyületet, ahol R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szek-butilcsoport, vagy olyan vegyületet mely a fermentációs folyamatok során az említett RCOOH vegyületté képes átalakulni. Ezek a mutánsok azonban melepetésszerűen és váratlanul természetes és nem-természetes avermektineket termeltek, ha a fermentáció R-COOH általános képletű - ahol R jelentése izopropilcsoport, (S)-szek-butil-csoport vagy más itt tárgyalt csoport - vegyidet vagy annak előanyaga jelenlétében történt. Még meglepőbb, hogy az itt leírt olyan mutánsok, melyek csak az elágazó láncú- 2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkeznek és képesek lebontani az L-izoleudnt, az L-leudnt vagy az L-valint, a vegyületek széles variációját fel tudják használni az avermektin bioszintézisénél, természetes avermektineket nem tartalmazó, nem-természetes avermektineket termelve. Az ilyen egyszeresen blokkolt mutánsok további mutagenezise olyan mutánsok keletkezéséhez vezet, melyek nem rendelkeznek az elágazó láncú-2- oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással és a avermektin- B-O-metil-transzferáz aktivitással sem. Az ilyen kettősen blokkolt mutánsok meglepően és váratlanul lényegében csak avermektin-B-komponenseket termelnek, ha a fent meghatározott RCOOH általános képletű vegyületet adjuk a tenyészethez. Mint már említettük, a természetes avermektinek nyolc különálló, de egymáshoz nagyon hasonló komponensből állnak, melyeknek (I) általános képletében R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szekbutil-csoport. Noha lényegében tiszta állapotban nyerhetők ki (lásd 4 429 042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom), az eljárás a legjobb esetben is munkaigényes. A B-avermektinek antelmintikus aktivitása általában jobb, mint a megfelelő A-avermektineké. A nem-természetes avermektinek (A és B komponensek) EP 214731 szabadalom szerinti előállításánál különböző mennyiségben természetes avermektinek is termelődhetnek, minthogy jelen van az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz és a S.avermitilis sejtjeiben és a tápközegben az L-valin és L-izoleucin aminosav. A kívánatos cél: csak a biológiailag hatásosabb, 3 természetes vagy nem-természetes B-komponensek termelése; a termékek számának, a termékkeverék komplexitásának csökkentése; az adott avermiktin tisztaságának növelése, és ezáltal az elválasztási eljárás egyszerűsítése. Az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező S.avermitilis törzseket az avermektintermelő S.avermitilis, főként az S.avermitilis ATCC 31267, AZCC31271, ATCC 31272 vagy az NCIB 12121 törzsek mutagenezisével állítjuk elő. A mutánsok képtelenek a természetes avermektinek szintézisére, hacsak izopropilcsoportot vagy (S) -szek-butil- csoportot tartalmazó zsírsavat vagy annak előanyagát nem adjuk a tápközeghez. A mutánsok természetes és nem-természetes avermektineket képesek termelni, ha vizes, aerob körülmények között tenyésztjük őket, olyan táptalajon, mely megfelelő primer savat vagy a fermentációs folyamatokban azzá átalakuló előanyagot tartalmaz. 14 A mutagenizált telepek közül a 1 C izotóppal jelzett széndioxid-termelés alapján választjuk ki azokat, melyek nem rendelkeznek az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással. Ennél az eljárásnál azt a jelenséget használjuk fel, hogy az említett enzimaktivitással nem rendelkező permeabilizált sejtek a [14C-l]-2-oxo-izokapronsav vagy a [14C-l]-2-oxo-3-metil-vajsav szubsztrátokból nem termeinek 14C izotóppal jelzett széndioxidot. Meglepő és váratlan, hogy az itt ismertetett, az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsok megtartják avermektineket, főleg a nem-természetes avermektineket termelő képességüket. Az a tény, hogy a szokásos táptalajon növekvő mutánsok képtelenek természetes zsírsav-koenzim-A-származékokat termelni, letális mutációt jelenthet, ha a membránok integritása az említett származékoktól függ, vagy, ha a 2-oxo-sav felhalmozódása citotoxicitáshoz vezet. Nem volt továbbá várható, hogy a mutánsok képesek az L-izoleucin és az L-valin degradatív metabolizmusa révén acetil-koenzim-A-t vagy propionilkoenzim-A-t szintetizálni, minthogy ez olyan enzimaktivitásokat igényel, amivel a mutánsok nem rendelkeznek. A fent említett avermektin bioszintézis acil-koenzim-A iránti igénye alapján azt várhatnánk, hogy a mutánsok nem-természetes avermektin termelése súlyosan zavart. A várakozással ellentétben, nem ez a helyzet. Az itt leírt mutánsok elágazó láncú-2-oxo-savdehidrogenáz aktivitásának a hiánya megakadályozza az elágazó láncú acil-koenzim-A L-izoleucin, L-leucin és L-valin lebomlásával kapcsolatos szintézisét, és ezáltal a természetes avermektinek szintézisét is, hacsak a fermentációs tápközegben nem adunk R-COOH általános képletű vegyületet vagy előanyagát, ahol R jelentése (S)-szek-butilcsoport vagy izopropilcsoport. A 2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsok mutagenezisével továbbá olyan mutánsokhoz juthatunk, melyek az avermektin-BO-metil-transzferáz aktivitással sem rendelkeznek. Az avermektin-B-O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező mutánsok képtelenek az avermektin aglikonok 5-ös helyzetű oxigénjét metilezni. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
