201973. lajstromszámú szabadalom • Eljárás avermektin B-származékok előállítására
HU 201973 B 5 6 Ezek a mutánsok lényegében csak B-vermektinek termelésére képesek, az A-avermektinekére nem. A találmány szeirat (I) általános képletű avermektin-származékokat állítunk elő, ahol R hidroxicsoport, ha a 22,23-kettőskötés hiányzik, vagy hidrogénatom, ha a 22,23-kettőskötés jelen van, R2 (II) képletű 4’-(a-L-oleandrozil)-ot-L-oleandrozil-oxi-csoport, R jelentése a-helyzetben elágazó láncú 3-7 szénatomos alkil-, 3-7 szénatomos alkenil-, 3-7 szénatomos alkinil-, (1-4 szénatomos alkoxi)-3-7 szénatomos alkil- vagy (1-4 szénatomos alkiltio)-2-7-szénatomos alkilcsoport; adott esetben egy vagy két halogénatommal vagy egy metiléncsoporttal szubsztituált 3-8 szénatomos cikloalkilcsoport; egy 5-8 szénatomos cikloalkenilcsoport; furami-, tetrahidrofuranil-, dihidropiranil-, tetrahidropiranil-, tetrahidro-tiopiranil-, tetrahidrotienil- vagy tienilcsoport. Az itt leírt mutánsok a nem-természetes B-avermektinek leírt és példákkal szemléltetett előállítása szempontjából nagy értékűek. Különösen hasznosak ezek a mutánsok az előnyös avermektinek, azaz a 25-ös szénatomon 4-6 szénatomszámú cikloalkilvagy cikloalkenil-csoportot, 1-metil-tio-etil-csoportot vagy 3-tienil- vagy 3-furilcsoportot viselő avermektinek előállítása szempontjából. Az avermektint termelő Streptomyces avermitilis törzsek mutációs kezelését az ismert eljárások szerint végezzük a szokásos mutagén faktorokkal, azaz ultraibolya fény vagy Röntgen besugárzással, N-metil-N’-nitro-nitrozo-guanidinnal, etil-metánszulfonáttal, salétromossawal, N-mustárral, például N-metil-bisz(2-klór-etil)-aminnal, stb. történő kezeléssel. A mutagenezist természetes avermektineket termelő S.avermitilis, például S.avermitilis ATCC 31272 törzs spóráin vagy vegetatív tenyészetén végezhetjük. A szakemberek által jól ismert eljárást követve, az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsokat a biokémiai vizsgálati eljárás alapján szelektáljuk, mely lehetővé teszi, hogy a random mutagenizált baktériumtelepek nagy számát megvizsgáljuk abból a szempontból, hogy bizonyos elágazó láncú [14C-l]-2-oxo-savakból termelnek-e 14C izotóppal jelzett széndioxidot (Tabor é» munkatársai, J.Bact., 128: 485-486 /1976/). _ Az eljárás abból áll, hogy a mutáns telepeket alkalmas táptalajon, mikrotiter lemez lukaiban növesztjük, a sejteket toluollal permabilizáljuk, majd [14C-l]-2-oxo-savat (például 2-oxo-izokapronsavat) adunk minden egyes lukba, és vizsgáljuk a 14CŰ2 jelenlétét a tenyészet feletti légtérben. A [;4C-l]-2-oxo-izokapronsav helyett használhatunk [14C-l]-2-oxo-3-metíl-valeriánsavat vagy [14C-l]-2- oxo-3-metil-vajsavat. A l4C izotóppal jelzett széndioxid termelődését a szokásos módon mutatjuk ki, vagyis bárium-hidroxiddal átitatott szűrőpapírt helyezünk az egyes lukak fölé, ami megköti a l4C02-t, bármennyi is termelődött, és a 14C izotóppal jelzett ábrium-karbonátot autoradiográfiával kimutatjuk. Azoknál a mutánsoknál, ahol hiányzik az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogcnáz aktivitás, az adott 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 autoradiogramm közel azonos a vak kontroliéval (nem beoltott luk), azaz a mutáns nem eredményez több jelzett bárium-karbonátot. Az így nyert mutánsokat további, fent említett mutagén kezelésnek vethetjük alá. A mutagenizált telepeket az avermektin-B-O-metil-transzferáz aktivitás szempontjából vizsgáljuk tovább. Ehhez kromatográfiás (vékonyréteg vagy HPLC) eljárást használunk, a hozzáadott előanyag- például 2-metil-vajsav-jelenlétében végzett fermentálást követően. Az avermektin-B-O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező mutánsoknál a fermentléből lényegében hiányoznak az A-avermektin komponensek. Egy adott törzs kívánt alléljeit a mikroogranizmus mutagén kezelése mellett előállíthatjuk protoplaszt fúzióval is. így például egy S.avermitilis törzset, mely nem rendelekzik sem az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz, sem az avermektin-BO-metil-transzferáz aktivitással fuzionálhatunk egy, a fenti aktivitással rendelkező S.avermitilis törzzsel. A fúzió olyan S.avermitilis törzset eredményezhet, mely csak az avermektin-B-O-metiltranszferáz aktivitással rendelkezik. Amint az a szakemberek előtt ismert eltérő szelekciós vonalú törzsek kívánt alléljeit egyetlen törzsbe egyesíthetjük a protoplasztfúziós technikával. A találmány szerinti eljárással alkalmazott mutánsok alaktani és tenyészeti tulajdonságai hasonlóak a 4 429 042 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírtakéhoz. A találmány szerinti mutánsok megkülönböztető tulajdonságai: az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitás és a B-avermektin-O-metil-transzferáz aktivitás hiánya, mely tulajdonságokat az itt leírtak alapján határozzuk meg. Az említett aktivitások hiánya azt eredményezi, hogy a mutánsok nem termelnek természetes B-avermektineket, ha a tenyésztés RCOOH általános képletű - ahol R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szek-butil-csoport - zsírsavakat, vagy a fermentáció alatt ezekké átalakuló vegyületeket nem tartalmazó szintetikus táptalajon történik. Az American Type Culture Collection alapján végzett rendszertani vizsgálatok megerősítik, hogy a fenti 14C02 teszttel szelektált 1-3 mutáns törzs szoros rokonságot mutat a 4 429 042 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírt ATCC 31272 szülőtörzzsel, de vannak bizonyos eltérések is. így például az 1-3 (ATCC 53567) lényegesen kevesebb spórafűzért képez, mint az ATCC 31272 törzs. A hasznosítási kísérletek szerint, az 1-3 törzs nem hasznosítja növekedéséhez a raffinózt. Ellentétben az ATCC 31272 törzs 4 429 042 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírt tulajdonságával, nem tapasztaltunk növekedést szacharózon, mint egyetlen szénforráson sem mutáns sem az ATCC 31272 törzs esetében. Az 1-3 mutáns nem rendelkezik elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással. A találmány szerinti eljárás mikroorganizmusa az elágazó-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással és a B-avermektin-O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező S.avermitilis 7881 törzs, mely az 1-3 (ATCC 53567) mutáns további mutagenezisével keletkezett, az 1-3 mutánshoz hasonló rendszertani 4
