201972. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumor ellenes 4'-dezoxi-13(S)-dihidro-4'-jód-doxorubicin-hidroklorid előállítására a 4'-dezoxi-4'-jód-doxorubicin sztereoszelektív mikrobiológiai redukciójával
HU 201972 B 5 6 I. Táblázat A (II) képletű FCE 24883,4’-dezoxi-13(S)-dihidro-4’-jód-doxorubicin in vitro citosztatikus aktivitása, összehasonlítva a 4’-dezoxi-4’-jód-doxorubicin (I, FCE 21954) és a doxorubicin (Dx) citosztatikus aktivitásával Vegyület HeLab ID50 (ng/cm3)3 P388c DX 10,8 FCE 21954(1) 10,4 FCE 24883 (II) 8 8 2,1 3,5 a = a kezeletlen kontrolihoz képest 50% sejtszám-csökkenést adó dózis; b = emberi nyaki fedőhám karcinoma sejtek; c = P388 leukémia sejtek. II. Táblázat Gross leukémiával szembeni in vivo tumor-ellenes aktivitás a 4’-dezoxi-13(S)-dihidro-4’-jód-doxorubicin (II. FCE 24883); a 4’-dezoxi-4’-jód-doxorubicin (I. FCE 21954), és doxorubicin (DX) esetében Cegyület Dózis3 mg/kg TC%b Toxikus halál0 DX 10 200 (200, 200) 0/20 13 225 (23,220) 0/20 16,9 250 (260,240) 2/20 FCE 21954(1) 4 240 (240, 240) 0/20 5,2 260 (260, 260) 4/20 6,8 145 (160,130) 19/20 FCE 24883 (II) 4 180 (180) 0/10 5,2 220 (220, 220) 0/20 6,8 220 (220, 220) 0/20 8.8 140 (140) 5/9 a = C3H egereket 2 x 106 leukémia sejttel oltottunk be intravénásán, majd egy nappal a tumor-injektálás után végeztük a kezeléseket; b = (a kezelt egerek közepes túlélési ideje/a kontroll egerek túlélési ideje) X100; c = az elpusztult egerek boncolási adatai alapján kapott érték. A következő példák a találmány szerinti eljárás további részleteit világítják meg. Ugyanakkor a példák nem korlátozzák a találmny oltalmi körét. 1 1. példa Streptomyces peucetius M 87 F. I. (DSM 2444) törzset tenyésztünk a következő: glükóz 3%; szárított sörélesztő 1,2%; NaCl 10,1%; KH2PO4 0,05%; CaC03 0,1%; MgS04 0,005%; FeS04 x 7H20 0,0005%; ZnS04 x 7H20 0,0005%; CuS04 x 5H20 0,0005%; agar 2%; csapvízzel 100 cm3-re töltjük, pH-ját 6,7-re állítjuk be, majd autoklávban 20 percen át 115 °C-on sterilizáljuk. Az így tenyésztett kultúra spóráit összegyűjtjük, 3 cm3 steril desztillált vízben szuszpendáljuk, majd ezzel a szuszpenzióval oltjuk be a 300 cm-es Erlenmeyer lombikban levő alábbi összetételű tápoldatot: szárított sörélesztő 0,3%; pepton 0,5%; Ca(N03)2 x4H20 0,05%; vízzel 100 cm-re feltöltve. A tápoldatot autoklávban 20 percen át 120 °C-on sterilizáljuk. A tápoldat pH-ját a sterilizálás után 6,8-7 közé állítjuk. A beoltott tápoldatot tartalmazó lombikokat 2 napon át 28 °C-on 7 cm átmérőjű kört leíró 250 ford./perc sebességű rotációs rázógépben rázatjuk. Az így tenyésztett kultúrából 1,5 cm3-rel beoltjuk a 300 cm3- es Erlenmeyer lombikban levő alábbi összetételű, s 40 alábbi módon elkészített biotranszformációs tápoldatokat (50 cm3): élesztő kivonat 1,5%; KH2P04 0,25%; glükóz 1,5%; csapvízzel 100 cm-re töltjük, pH-ját 6,9-re állítjuk be; autoklávban 20 percen át 115 °C-on sterilizáljuk. A glükóz oldatot külön ste- 45 rilizáljuk, s így adjuk a kívánt összetétel eléréséig a már sterilizált lombikokhoz. Ekkor az (I) képletű vegyület hidroklorid sója 5 mg/cm3 koncentrációjú, steril desztillált vízzel készült oldatának 1-1 cm3-ét adjuk a lombikokhoz. A rázatott lombikokat továb- 50 bi két napig inkubáljuk, s így az (I) vegyület 70%-os konverzióval alakul át a (II) képletű veggyületté. 2. példa Streptomyces peucetius M 87 F. I. kultúrát te- 55 nyésztünk az 1. példában leírt szilárd táptalajon. Három tenyészet spóráit összegyűjtjük és 10 cm3 steril desztillált vízben elszuszpendáltatjuk; az így nyert szuszpenzióval beoltunk 500 cm3, az 1. példában leírt, 2 dm3-es gömblombikban levő tápoldatot. 60 A lombikot 48 órán át 28 °C-on 120 ford./perc sebességű, 7 cm átmérőjű kört leíró rotációs keverőben kevertetjük. Az így nyert tenyészettel beoltunk 7,5 dm3, az 1. példában leírt összetételű, 10 dm3-es rozsdamentes acél fermentorban levő 65 biotranszformációs tápoldatot, melyet 120 °C-on 4
