201972. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumor ellenes 4'-dezoxi-13(S)-dihidro-4'-jód-doxorubicin-hidroklorid előállítására a 4'-dezoxi-4'-jód-doxorubicin sztereoszelektív mikrobiológiai redukciójával
HU 201972 B 30 percig sterilezőnk, a glükóz oldatot külön sterilezés után adagoljuk a kívánt koncentráció eléréséig a fermentorba. A kultúrát 28 °C-on 230 ford./perc keverés és 0,7 dm3 levegő/dm3 tápoldat/perc levegőztetés mellett inkubáljuk. 48 óra elteltével az 1. példában leírt módon adagoljuk hozzá a szubsztrát vegyületet, majd további 3 napig inkubáljuk, s így az (I) vegyület 60%-os konverzióval a (II) képletű vegyületté alakul. 3. példa A 2. példa szerinti fermentációnál nyert fermentumot (5 dm3) 2% kovaföld felhasználásával szűrjük. A nedves szűrési maradékot 3 dm3 acetonnal extraháljuk, szűrés után a pogácsát még kétszer extraháljuk acetonnal, hogy a vörös pigmenteket teljes mértékben kinyerjük. Az egyesített acetonos extraktumokat vákuumban betöményítjük, a koncentrátumot (1 dm3) és a szűrletet 8-as pH-n kimerítően extraháljuk diklór-metán-metanol 9:1 arányú elegyével. A szerves extraktumot, mely az (I) és (II) vegyületeket és kis mennyiségben bomlási termékeiket tartalmazza, csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A diklór-metánban feloldott maradékot pH 7-re pufferolt (M/15 foszfát-puffer) szilikagéloszlopon kromatografáljuk gradiens elucióval diklór-metán-metanol-víz rendszerben. A bomlási termékek eluciója után 95:5:0,25 arányú elegyben eluálódik az (I) vegyület, majd ezt követi 90:10:0,5-ös rendszerben a (II) FCE 24883 vegyület. Az összegyűjtött frakciókból vizes mosás, kis mennyiségű n-propanol jelenlétében való betöményítés és ekvivalens mennyiségű sósav és nagy feleslegben adagolt n-hexán hozzáadása után a (II) képletű FCE 24883 vegyület (0,30 g, 60%) tisztán, hidrokloridként (o.p. = 200 °C) nyerhető ki. Ugyanezzel a módszerrel az át nem alakult (I) vegyület (0,13 g, 26%) szintén hidrokloridként nyerhető ki. 7 4. példa Az (I) képletű FCE 24883 vegyületet (200 mg) 0,2 N vizes sósav (50 cm3) oldatban feloldjuk, majd 30 percen át 100 °C-on melegítjük. A kristályos vörös csapadékot (0,12 g), mely a (III) képletű ágiikon, szűréssel összegyűjtjük, vízzel mossuk és szárítjuk. Tömegspektruma: m/e 416 (M+). A (III) képletű ágiikon autentikus mintával összevetve 13-(S)dihidro-adriamicinonnak bizonyult. SZABADALMI IGÉNYPONT Mikrobiológiai eljárás a (II) képletű 4’-dezoxi- 13(S)-dihidro-4’-jód-doxorubicin-hidrokloridján ak előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces peucetius DSM 2444 deponálási számú mikroorganizmus törzset aerob körülmények között, vizes, asszimilálható szénforrást, asszimilálható nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó tápoldatban tenyésztjük az (I) képletű 4’-dezoxi-4’-jód-doxorubicin-hidrokloridjának jelenlétében, 27-30 °C hőmérsékleten, 72 óra - 5 nap alatt, a kapott nyers elegyből a szilárd folyékony fázist elválasztjuk a micélium pogácsából előnyösen acetonnal, és a leszűrt fermentációs folyadékból pH 8-on, előnyösen diklór-metán:metanol 9:1 térfogatarányú eleggyel extrahálunk, majd az egyesített extraktumokat vákuumban bepároljuk, a vákuumbepárlás maradékaként kapott nyers terméket diklór-metánban oldjuk, pH 7-re pufferolt szilikagél-oszlopon kromatográfiás tisztításnak vetjük alá, a reakcióba nem lépett kiindulási anyagot célszerűen diklór-metán:metanol:víz (95:5:0,25 tf) eluciós rendszerrel eltávolítjuk, majd előnyösen diklór-metán:metanokvíz (90:10:0,5 tf) eluciós rendszert használunk; a kapott frakciókat kis mennyiségű n-propanol jelenlétében betöményítjük, és a szabad bázisként kapott (II) képletű 4’-dezoxi-13(S)-dihidro-4’-jóddoxorubicint hidrogénklorid formájában ekvivalens mennyiségű sósav és feleslegben adagolt n-hexán hozzáadásával kinyerjük. 8 5 10 15 20 25 30 35 40 5
