201965. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antikoaguláns hatású hirudin-peptidek előállítására
HU 201965 B módon köthetjük a gyantához. A kereskedelemben sokféle, gyantához kötött, védett aminosav kapható. Például olyan (I) általános képletű polipeptid előállítására, melyben a karboxi láncvég egy Thr savmaradék, egy hodroxi-metilezett fenil-acetamido-metil (PAM) gyantához kötött, terc-butil-oxikarbonil-csoporttal védett Thr-t alkalmazunk, mely kereskedelmi forgalomban kapható. Miután az a-amino-védett aminosavat a hordozó gyantához kötöttük, a védőcsoportot az ismert módszerekkel - például trifluor-ecetsawal metilén-kloridban vagy anélkül, vagy dioxánban sósavval - 0 °C és szobahőmérséldet közötti hőmérsékleten lehasítjuk. Használhatunk más, a specifikus aaminovédő csoportok lehasítására szokásosan alkalmazott módszereket és reagenseket is. Az aamino-védő csoport eltávolítása után a többi amino-védett aminosavat lépésről lépésre a kívánt sorrendben kapcsoljuk össze. Olyan eljárást is követhetünk, hogy a gyantán megkötött aminosav-szekvenciával történő összekapcsolás előtt több aminosavat oldatban összekapcsolunk. Az a-aminovédő csoport, melyet az aminosavszekvenciába beépítendő aminosavak mindegyikében alkalmazunk, bármely ilyen, a szakmában ismert védőcsoport lehet. Ide tartoznak (1) az acil-típusú védőcsoportok, mint például forrni!-, trifluoracetil-, ftalil-, toluolszilfonil- (tozil-), benzolszulfonil-, nitrofenilszulfenil-, tritilszulfenil-, o-nitro-fenoxi-acetil-, a-butiril-csoport, (2) az aromás uretán típusú védőcsoportok, mint például benzil-oxi-karbonil- és szubsztituált benzil-oxi-karbonil-, (mint például p-klór-benzil-oxi-karbonil-, p-nitrobenzil-, karbonil-, p-bróm-benzil-oxi-karbonil-, p-metoxibenzil-oxi-karbonil-, l-(p-bifenil-il)-l-metil-etiloxi-karbonil-, a,a-dimetil-3,5-dimetoxi-benzil-oxikarbonil-, benzihidril-oxi-karbonil-csoport, (3) az alifás uretán védőcsoportok, mint például terc-butil-oxi-karbonil- (Boc), diizopropíl-metoxi-karbonil-, izopropil-oxi-karbonil-, etoxi-karbonil-, alliloxi-karbonil-csoport, (4) a ciloalkiluretán típusú védőcsoportok, mint például ciklopentil-oxi-karbonil-, adamantil-oxi-karbonil-, ciklohexil-oxi-karbonil-csoport, (5) a tiouretán tíousú védőcsoportok, mint például a fenil-tiokarbonil-csoport, (6) az alkil típusú védőcsoportok, mint például trifenilmetil- (tritil)- és benzilcsoport, valamint (7) a trialkil-szilán-csoportok, mint például a trimetil-szilán. Előnyösen alkalmazható a-aminovédő csoport a terc-butil-oxi-karbonil-csoport. A megfelelő kapcsolási reagenst a szakmában ismertek közül választjuk, melyek például a következők: (1) a karbodiimidek (pl. N,N’-diciklohexilkarbodiimid és N-etil-N’-(-y-dimetil-amino-propilkarbodiimid), (2) a ciánamidok (pl. az N,N’-dibenzil-ciánamid), (4) az izoxazolium-sók (pl. az N-etil- 5-fenil-izoxazolium-3’-szulfonát), (5) az aromás jellegű monociklus, nitrogéntartalmú heterogyűrűs amidok, melyek a gyűrűben 1-4 nitrogénatomot tartalmaznak, mint például az imiazolidok, pirazolidok és az 1,2,4-triazolidok (így pl. az N,N’-karbonil-diimidazol és az N,N-karbonil-di-l,2,4-triazol), (6) az alkoxilezett acetilének (pl. etoxi-acetilén), (7) az aminosav karboxi-részével vegyes anhidridet képző reagensek (pl. etil-klór-formát és izobutil-3 klór-formát) vagy a kapcsolandó aminosawal szimmetrikus anhidridet képző reagensek (pl. Boc-Ala-0- Ala-Boc) és (8) olyan nitrogéntartalmú heterogyűrűs vegyületek, melyek az egyik gyűrű-nitrogénen egy hidroxicsoportot tartalmaznak (pl. N- hidroxi-ftálimid, N-hidroxi-szukcinimid vagy 1-hidroxi-benzotriazol). Kapoor IJ. Pharm. Sei., 59, pp. 1- 27 (1970) leír egyéb aktiváló reagenseket is, valamint ezek alkalmazását peptidek kapcsolására. A kapcsoláshoz előnyösen alkalmazható reagensek a szimmetrikus anhidridek. Az egyes aminosavakat vagy aminosav-szekvenciákat körülbelül négyszeres feleslegben adagoljuk be a szilárd fázisú reaktorba, és a kapcsolást 1:1 arányú dimetil-formamidmetilén-klorid elegyben vagy csak dimetil-formamidban vagy előnyösen csak metilén-kloridban hajtjuk végre. Ha a kapcsolódás nem megy végbe tökéletesen, akkor - mielőtt a következő aminosavat bevezetnénk a szilárd fázisú reaktorba, és az a-aminovédő csoport eltávolítása előtt - a kapcsolási eljárást megismétejük. A kapcsolási reakció sikerességét a szintézis minden egyes lépésében az E. Kaiser és munkatársai [Analyt. Biochem. 34, 595 (1970)] által leírt ninhidrin-reakcióval figyeljük. Miután a kívánt aminosav-szekvenciát megkaptuk, a pepiidet eltávolítjuk a gyantáról. Ezt végezhetjük hidrolízissel, pl. úgy, hogy a gyantához kötött polipeptidet dimetil-szulfid, p-krezol és tiokrezol híg vizes hidrogén-fluoridos oldatával kezeljük. Mint az a szilárd fázisú peptiszintézis gyakorlatából ismert, sok aminosav olyan funkciós csoportokat tartalmaz, melyeket a lánc kialakítása során védeni kell. A megfelelő védőcsoport kiválasztása és alkalmazása a szakmában jártasak számára egyszerű feladat. Az alkalmazandó védőcsoportot a védeni kívánt aminosavtól és a pepiidben jelenlevő más védett aminosav-maradéktól függően kell megválasztani. Az ilyen oldalláncvédő csoportok kiválasztása kritikus feladat, mert ezeknek az aaminovédő csoport eltávolítása során nem szabad lehasadniuk. Ezek a védőcsoportok a szakmában ismert módszerekkel távolíthatók el. A védőcsoportokat általában a peptidlánc szintézisének befejezése után hasítjuk le, de ezt a műveletet bármely más alkalmas időpontban is elvégezhetjük. A találmány szerinti eljárással előállított peptidszármazékok koagulálásgátló mennyisége - a pacienstől, a kezelendő trombotikus állapot súlyosságától és a választott vegyülettől függően - a beteg 1 testsúly-kg-jára számítva napi 0,2 mg-tól 250 mg-ig terjed. A beteg számára alkalmas egyedi dózis könnyen meghatározható, általában napi 1-4-szer, dózisonként 5 és 100 mg közötti hatóanyagot tartalmazó készítményt adunk be. Az antikoaguláns terápia javallott egy sor trombotikus állapot - különösen a szívkoszorúéri és agy-érrednszeri betegségek - kezelésére és megelőzésére. A szakmában jártasak ismerik az antikoaguláns terápiát igénylő körülményeket. A „beteg” kifejezésen itt emlősöket - mint pl. főemlősök, beleértve az embert, továbbá juhot, lovat, szarvasmarhát, sertést, kutyát, macskát patkányt, egeret - értünk. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
