201965. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antikoaguláns hatású hirudin-peptidek előállítására
HU 201965 B Bár egyes peptid-származékok sértetlenek maradhatnak, miközben az orális beadást követően a nyelőcsövön áthaladnak, előnyösebb, ha a készítményt nem orális úton, például szubkután, intravénása«, iptramuszkulárisan vagy intraperitoneáli- 5 san, depot injekció vagy implant alakjában adjuk be, vagy pedig az orr, a torok vagy a hörgők nyálkahártyáira alkalmazzuk, például aeroszolként, mely a találmány szerinti eljárással előállított peptidszármazékot spray vagy száraz por alakjában tártál- 10 mázzá. Parenterális beadás céljára a találmány szerinti eljárással előállított vegyületekből valamely fiziológiailag elfogadható hígítószerben, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyag - mely lehet egy steril 15 folyadék, például víz vagy olaj - és felületaktív anyagok vagy egyéb, gyógyászatilag elfogadható adalékok hozzáadásával oldatot vagy szuszpenziót állíthatunk elő injektálható dózisok formájában. E készítményekben olajként alkalmazhatunk ásványi, 20 állati, növényi eredetű vagy szintetikus olajokat, például földimogyoró-, szója- vagy ásványolajat. Általában - és különösen injektálható oldatok készítéséhez - előnyösen alkalmazható folyékony hordozóanyagok a víz, fiziológiás sóoldat, vizes 25 dextróz- vagy invertcukor-oldatok, etanol, és a glikolok, mint propilén-glikol vagy poli-(etilén-glikol). A szóbanforgó vegyületeket késleltetett hatóanyag-leadású depot-injekció vagy implant készít- 30 mény alakjában is beadhatjuk. A hatóanyagból pelleteket, vagyis apró hengereket sajtolunk, és ezeket szubkután vagy intramuszkulárisan depot injekció, illetve implant formájában adjuk be. Az implantokban alkalmazhatunk inert anyagokat, például bio- 35 lógiai úton lebontható polimereket vagy szintetikus szilikonokat, mint például a Silastic, a Down-Corning Corp. szilikonkaucsuk-gyártmánya. Az alábbi példák a találmány illusztrálására szolgálnak, annak oltalmi körét nem befolyásolják. 40 1. példa Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pip-Glu-Glu-Ala-Cha-D -Glu-OH előállítása A peptidet szilárd fázisú eljárással szitnetizáljuk 45 0,5 mmól 0,56 mmól/g koncentrációjú Boc-DGlu(Blz)-Merrifield gyanta alkalmazásával. 2,0 mmól Na-Boc-aminosawal (Peptides International) kettős szimmetrikus anhidrid kapcsolást hajtunk végre, kivéve a Boc-Pip-et, melyet csak 50 egyszeresen kapcsolunk. Az oldalláncot Glu(Blz)vel és Tyr(Blz)-vel védjük. A láncvégzáró Na-Boc védőcsoportot metilén-klorid és trifluorecetsav 50%-os elegyével távolítjuk el. A gyantát metilén-5 kloriddal háromszor átmossuk, 10%-os metilénkloridos diizopropil-etil-aminnal háromszor átmosva semlegesítjük, majd metilén-kloriddal ismét 3 x mossuk. A peptidlánc végét dimetil-formamidban oldott 1,0 g szukcinanhidriddel zárjuk, metilénkloriddal 3 x mossuk, majd szabad aminra viszgáljuk. A láncvégzáró reakciót még kétszer megismételjük, majd a gyantát megszárítjuk. A gyantáról a peptidet és a pepiidről a védőcsoportokat 0 °C-on, 45 percen át, 5% anizolt tartalmazó hidrogénfluoriddal hasítjuk el. A hidrogén-fluoridot 0,1- 2800 Pa-os vákuumban, 0 °C-on eltávolítjuk, a peptidet 30%-os vizes acetonitrillel leoldjuk a gyantáról és liofilizáljuk. A peptidet 50,8 c 150 mm-es C18 Beckman oszlopon végzett preparatív HPLC kromatográfiával tisztítjuk, eluensként 33-38% acetontrilt tartalmazó 0,1%-os vizes TFA oldatot alkalmazunk 79 ml/perc sebességgel. A legmagasabb csúcshoz tartozó frakciót leszűrjük, liofilizáljuk, majd ugyanazon az oszlopon, gradiensként 80 ml/perc sebességű, 34-35,5% acetonitrilt tartalmazó 0,1%-os vizes TFA oldatot alkalmazva tovább tisztítjuk. A preparatív HPLC 50,8 x 150 mm-es C18 Beckman oszlopon végezzük, eluensként 33-38% acetonitrilt tartalmazó 0,1%-os vizes TFA oldatot alkalmazunk 79 ml/perc sebességgel. A legmagasabb csúcshoz tartozó frakciót leszűrjük és liofilizáljuk, így 101 mg-ot kaOpunk a kívánt termékből (a gyantán eredetileg kötött peptidre vonatkoztatva 58%os kihozatal). A homogenitást HPLC és TTLC kromatográfiával határozzuk meg. A HPLC-t 250 x 4,6 mm-es Vydac 218TP54 C18 oszlopon, 2 ml/perc sebességgel végezzük, t0 = 1,9 perc, eluciós idő 15- 40%-os acetonitrillel 0,1%-os trifluor-ecetsavban 1%/perc lineáris gradienssel 14,4 perc. Aminosav elemzési eredmények (hidrolízis 6n sósavval 24 órán át 106 °C-on): Glx 4,02 (4); Pro 0,99 (1); Alá 0,99 (1); Ile 0,95 (1); Tyr 0,97 (1); Pip 1,08 (1); e275 = 1490. Peptid-tartalom: 91,5 tömeg%. Hasonló módon állítjuk elő az alábbi 2-4. példa szerinti peptideket: 2. példa Suc-Tyr-Glu-Pip-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-D -Glu-OH előállítása 3. példa Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Azd-Glu-Glu-Ala-Cha- D-Glu-OH előállítása 4. példa Suc-Tyr-Glu-Azd-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha- D-Glu-OH előállítása 6 Példa Aminosav elemzés (hidrolízis: 6N HC1,24 Ó, 106 °C) száma Glx Pro Alá Ile Tyr Pip Petid tart. 2. 3,97(4) 1,03(1) 0,98(1) 0,95(1) 0,98(1) 1,09(1) 84% 3. 4,04(4) 1,03(1) 0,98(1) 0,97(1) 0,98(1) 82% 4. 4,01(4) 1,04(1) 0,99(1) 0,96(1) 1,00(1) 86% 4
