201956. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szteroid-5alfa reduktáz inhibitorok és hatóanyagként ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 201956 B a nemtoxikus alkálifém- és alkáliföldfém-bázisokat, például kalcium-, nátrium-, kálium-hidroxidot, ammónium-hidroxidot alkalmazhatunk, valamint használhatunk nemtoxikus szerves bázisokat, így például trietil-amint, butil-amint, piperazint vagy (trihidroxi-metil)-metil-amint. Az (la) általános képletű vegyületek találmány szerinti eljárásának új köztitermékei a (II) általános képletű vegyületek, a képletben az A, B, C és D gyűrűk kettőskötései, X, Y, R1 és R2 jelentése az (I) képletnél megadott. Az (I) általános képletű vegyület találmány szerinti előállításának további új köztiterméke az (V) általános képlettel jellemezhető vegyületek csoportja — a képletben az A. B, C és D gyűrű kettőskötései, az X, Y, R1 és RZ helyettesítők jelentése az (I) képletre megadott. Minthogy az (I) általános képletű vegyületek szteroid 5a-reduktáz aktivitást gátló hatással bírnak, terápiásán hasznosak olyan betegségek és állapotok kezelésében, amelyek esetén a DHT aktivitás csökkentése kiváltja a kívánt terápiás hatást. Ilyen betegségek és állapotok például az acne vulgaris, a seborrhea, a női hirzutizmus, a prosztatabetegségek, például a jóindulatú prostata-hipertrófia, valamint a férfias típusú kopaszság. Néhány, a találmány szerint előállított vegyület humán szteroid 5a-reduktáz gátló hatását hiperpláziás humán protataszövetek alkalmazásával megvizsgáltuk. A humán enzim gátlására való képesség meghatározásánál a következő eljárást alkalmaztuk: Fagyasztott humán prosztatákat kiolvasztunk, és apró—5 mm3-es darabokra aprítunk. A szöveteket 3-5-szeres térfogatú 20 mmól/l-es, pH = 6,5-es káliumfoszfát pufferben homogenizáljuk, a fenti puffer 0,33 mól/1 szacharózt, 1 mmól/1 ditiotreitolt és 50 pmól/1 NADPH-t tartalmaz, a homogenizálást Brinkmann Polytron (Sybron Corporation, Westbury, New York) segítségével végezzük. Az oldatot ezután 3-5 percen át ultrahang hatásának tesszük ki, ehhez Sonifier (Branson Sonic Power Co.) készüléket alkalmazunk, majd az oldatot üveg-üveg érintkező-felületek között Dounce homogenizátorral (Kontes Glass Company, Vineland, New Yersey) kézzel homogenizáljuk. A prosztatarészecskéket 4 °C hőmérsékleten, 600 vagy 1000 g mellett 20 percig, majd 140.000 g mellett 60 percig végzett differenciálcentrifugálással nyerjük ki. A 140.000 g mellett végzett centrifugálás üledékét 5-10 szövettérfogat előzőekben ismertetett pufferrel mossuk, majd 140.000 g mellett ismét centrifugáljuk. A kapott üledéket 20 mmól/les, PH = 6,5-es kálium-foszfát pufferben szuszpendáljuk, a puffer 20% glicerint, 1 mmól/1 ditiotreitolt és 50 pmól/1 NADPH-t tartalmaz. A szuszpendált részecske oldatot -80 °C hőmérsékleten tároljuk. Etanolban lévő konstans mennyiségű [14C] tesztoszteront (52-55 mCi/mmól, New England Nuclear, Boston, MA) és a feltételezett inhibitor etanolos oldatának különböző mennyiségeit vizsgálócsövekbe helyezzük, és SAVANT Speed Vac. berendezésen szárazra pároljuk. Minden csőbe puffert, 20 pl 10 mmól/l-es NADPH-t és a prosztatarészecske oldat alikvot részét adjuk, az elegyet 50 mmól/l-es pH = 5,0-os nátrium-citrát oldattal 1,0 ml végtérfo9 gatra egészítjük ki. Az oldatot 37 °C hőmérsékleten 20-30 percig inkubáljuk, majd a reakciót 4 ml etilacetát hozzáadásával leállítjuk, és 0,25 pmól tesztoszteron, dihidrotesztoszteron, androsztándiol, illetve androsztándion hordozóanyagot adagolunk. A szerves fázist egy másik vizsgálócsőbe visszük át, és Speed Vac. berendezésen szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot 20-30 pl kloroformban oldjuk, és egy sávokkal előre ellátott 20x20 cm-es szilikagél vékonyréteglemez (Si 250F-PA, Baker Chemical) önálló sávjára cseppentjük fel, majd 1:9 arányú aceton:kloroform eleggyel kétszer megfuttatjuk. A sávokban lévő szubsztrát és termék radioaktivitását Bioscan Imaging Scanner segítségével (Bioscan, Inc., Washington, D.C.) megmérjük. Kiszámítjuk a termékbe átment radioaktív anyag százalékos mennyiségét, amiből meghatározzuk az enzimaktivitást. Az inkubálást mindig úgy végezzük, hogy 12%-nál több szubsztrát (tesztoszteron) ne fogyjon. A kísérletnél nyert adatokat számítógép segítségével egy lineáris funkcióhoz illesztjük úgy, hogy az enzimaktivitás reciprokát (1/sebesség) a változó inhibitor koncentrációhoz rendeltük [Dixon, M., Biochem. J., 55,170 (1953)]. Feltéve, hogy a szteroid inhibitor a tesztoszteronnal kompetitiv inhibitor, a gátlási konstans (Ki) az alábbi 1. egyenletből számítható: Ki= (B/A) (S/Km + 1)1. egyenlet ahol B jelentése az 1/sebesség tengely metszete, A az egyeses meredeksége, S a kísérletben alkalmazott szubsztrát (tesztoszteron) koncentrációja és Km a szubsztrát (tesztoszteron) külön kísérletben megállapított Michaelis-Menton konstansa, amelynek értéke 4,5 pmól/liter. A II. táblázatban az előző vizsgálatok eredményeit mutatjuk be, az eredményekből látható, hogy a vizsgált vegyületek a humán szteroid 5a-reduktáz hatásos gátlói. II. Táblázat Humán prosztata-szteroid 5a-reduktáz gátlási konstansai 10 Vegyület Ki (mmól/1) (6) képletű vegyület 5000 (7) képletű vegyület 2000 (8) képletű vegyület 30 (9) képletű vegyület 7 (10) képletű vegyület 4000 (11) képletű vegyület 52 (12) képletű vegyület 26 (13) képletű vegyület 85 (14) képletű vegyület 2200 (15) képletű vegyület 30 (16) képletű vegyület 50 (17) képletű vegyület 32 (18) képletű vegyület 50 (19) képletű vegyület 62 (20) képletű vegyület 110 (21) képletű vegyület 900 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
